Из Википедии, свободной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

Ограничение олигомера (сокращенно OR ) - это процедура обнаружения измененной последовательности ДНК в геноме . Меченый олигонуклеотид зонд является гибридизовал с ДНК - мишени, а затем обрабатывает с помощью фермента рестрикции . Если зонд точно соответствует цели, рестрикционный фермент расщепит зонд, изменив его размер. Однако, если целевая ДНК не точно соответствует зонду, рестрикционный фермент не будет влиять на длину зонда. Метод OR, который сейчас применяется редко, был тесно связан с развитием популярного метода полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Механизм ограничения олигомеров.

Пример [ править ]

В части 1а схемы олигонуклеотидный зонд, помеченный на его левом конце (звездочка), показан в верхней строке. Он полностью комплементарен своей целевой ДНК (здесь взятой из гена β-гемоглобина человека ), как показано в следующей строке. Часть зонда включает сайт распознавания рестрикционного фермента Dde I (подчеркнут).

В части 1b рестрикционный фермент расщепил зонд и его мишень (Dde I оставляет три основания неспаренными на каждом конце). Помеченный конец зонда теперь имеет длину всего 8 оснований и легко отделяется с помощью гель-электрофореза от неразрезанного зонда, длина которого составляла 40 оснований.

В части 2 показан тот же зонд, гибридизированный с целевой ДНК, которая включает мутацию одного основания (здесь мутация, ответственная за серповидноклеточную анемию , или SCA). Несоответствующий гибрид больше не действует как сайт узнавания для рестрикционного фермента, и зонд остается с исходной длиной.

История [ править ]

Методика рестрикции олигомеров была разработана как разновидность метода анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) с надеждой избежать трудоемкого этапа саузерн-блоттинга, используемого в ПДРФ-анализе. OR был разработан Рэндаллом Сайки и Генри Эрлихом в начале 1980-х годов, работая в Cetus Corporation в Эмеривилле, Калифорния . Он был запатентован в 1984 г. [1] и опубликован в 1985 г. [2] и был применен к геномной мутации, ответственной за серповидноклеточную анемию . OR был вскоре заменен более общей техникой аллель-специфических олигонуклеотидных зондов (ASO). [3]

Проблемы [ править ]

Метод ограничения олигомеров столкнулся с рядом проблем:

  • Его можно было применить только к небольшому набору полиморфизмов ДНК, которые изменяют сайт рестрикции, и только к тем сайтам, для которых была известна информация о последовательности. Многие из известных анализов RFLP выявляли полиморфизмы, которые находились далеко от мест расположения зондов.
  • Трудно маркировать олигонуклеотиды до достаточно высокого уровня, чтобы использовать их в качестве зондов для геномной ДНК. Эта проблема также мешала разработке зондов ASO.
  • Трудно сконструировать олигонуклеотиды и использовать их таким образом, чтобы они стали зондами гибридизации только для одного сайта в геноме. Привязка к неспецифическим местоположениям часто может скрыть эффект зонда в целевом местоположении.
  • Не все рестрикционные ферменты обладают желаемой специфичностью в отношении их последовательности распознавания. Некоторые могут распознавать и разрезать одноцепочечную ДНК, а некоторые демонстрируют низкий уровень расщепления несовпадающих сайтов. Даже небольшое количество неспецифического расщепления может подавить слабый сигнал, ожидаемый от целевой последовательности.
  • Было сложно разработать метод ИЛИ, который включал бы контроли для обоих тестируемых аллелей. В части 2 упрощенного примера, описанного выше, зонд не расщеплялся при гибридизации с мутантной мишенью. Но тот же (не-) результат будет иметь место для большого избытка негибридизированного зонда, а также если возникнет какая-либо проблема, препятствующая полному перевариванию рестриктазой. В описанном фактическом методе [2] второй неполиморфный сайт рестрикции использовали для вырезания всего гибридизированного зонда, а второй немеченый олигонуклеотид использовали для «блокирования» негибридизированного зонда. Эти элементы управления были бы недоступны для других целей.

Связь с ПЦР [ править ]

Несмотря на свои ограничения, метод OR извлек выгоду из его тесной связи с развитием полимеразной цепной реакции. Кэри Муллис , которая также работала в Cetus, синтезировала олигонуклеотидные зонды, тестируемые Сайки и Эрлихом. Осознавая проблемы, с которыми они сталкиваются, он представил альтернативный метод анализа мутации SCA, в котором будут использоваться компоненты техники секвенирования ДНК Сэнгера . Понимая сложность гибридизации олигонуклеотидного праймера с одним местом в геноме, он рассмотрел возможность использования второго праймера на противоположной цепи. Затем он обобщил этот процесс и понял, что повторное удлинение двух праймеров приведет к экспоненциальному увеличению сегмента ДНК между праймерами - aцепная реакция по репликации , катализируемой ДНК - полимераза . [4] [5]

Как Маллис столкнулся свои трудности в демонстрации ПЦР , [6] он присоединился к существующей группе исследователей , которые были на решение проблем с OR. Вместе они разработали комбинированный анализ ПЦР-ИЛИ. Таким образом, OR стал первым методом анализа геномной ДНК, амплифицированной с помощью ПЦР.

Маллис также столкнулся с трудностями при публикации основной идеи PCR (научные журналы редко публикуют концепции без сопроводительных результатов). Когда его рукопись для журнала Nature была отклонена, основное описание ПЦР было поспешно добавлено к статье, изначально предназначенной для описания метода OR (Муллис также был там соавтором). Эта статья OR [2], таким образом, стала первой публикацией PCR, и на несколько лет станет отчетом, наиболее цитируемым другими исследователями.

Ссылки [ править ]

  1. ^ Сайки Р.К., Эрлих, HA "Метод обнаружения полиморфных сайтов рестрикции и последовательностей нуклеиновых кислот". Патент США 4683194.
  2. ^ a b c Сайки, РК; Scharf S; Faloona F; Mullis KB; Erlich HA; Арнхейм Н (20 декабря 1985 г.). «Ферментативная амплификация геномных последовательностей бета-глобина и анализ сайтов рестрикции для диагностики серповидноклеточной анемии» . Наука . 230 (4732): 1350–4. Bibcode : 1985Sci ... 230.1350S . DOI : 10.1126 / science.2999980 . PMID  2999980 . Архивировано из оригинального 19 декабря 2008 года.
  3. ^ Saiki RK, Bugawan TL, Mullis KB и Erlich HE "Анализ ферментативно амплифицированной ДНК бета-глобина и HLA-DQa с аллель-специфическими олигонуклеотидными зондами" Nature vol. 324 (6093), стр. 163–166 (1986).
  4. ^ Mullis K "Необычное происхождение полимеразной цепной реакции" Scientific American vol. 262 (4): стр. 56-65 (1990).
  5. ^ Маллис К «Полимеразная цепная реакция», Нобелевская лекция, 8 декабря 1993.
  6. ^ Рабинов P «Создание ПЦР: история биотехнологии» Университет Чикаго Пресс (1996).