Патч зажим

Бактериальный сферопласт , залатанный стеклянной пипеткой

Патч-кламповая запись тока показывает переходы между двумя состояниями проводимости одного ионного канала: закрытым (вверху) и открытым (внизу).

Техника патч-кламп — это лабораторный метод в электрофизиологии , используемый для изучения ионных токов в отдельных изолированных живых клетках , срезах тканей или участках клеточной мембраны. Этот метод особенно полезен при изучении возбудимых клеток, таких как нейроны , кардиомиоциты , мышечные волокна и бета-клетки поджелудочной железы , а также может быть применен для изучения бактериальных ионных каналов в специально подготовленных гигантских сферопластах .

Фиксация патча может быть выполнена с использованием метода фиксации напряжения . При этом напряжение на клеточной мембране контролируется экспериментатором и регистрируются возникающие токи. В качестве альтернативы можно использовать метод токовых зажимов . В этом случае ток, проходящий через мембрану, контролируется экспериментатором, а результирующие изменения напряжения регистрируются, как правило, в форме потенциалов действия .

Эрвин Неер и Берт Сакманн разработали накладной зажим в конце 1970-х - начале 1980-х годов. Это открытие позволило впервые зарегистрировать токи молекул одиночных ионных каналов, что улучшило понимание участия каналов в фундаментальных клеточных процессах, таких как потенциалы действия и нервная активность. За эту работу Неер и Сакманн получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине в 1991 году. ^[1]

Базовая техника

Настраивать

Классическая установка накладного зажима с микроскопом , антивибрационным столом и микроманипуляторами.

Во время записи с помощью накладного зажима полая стеклянная трубка, известная как микропипетка или накладная пипетка, заполненная раствором электролита, и записывающий электрод , подключенный к усилителю, контактируют с мембраной изолированной ячейки . Другой электрод помещают в ванну, окружающую клетку или ткань, в качестве заземляющего электрода сравнения. Между записывающим электродом и электродом сравнения может быть сформирована электрическая цепь с интересующей ячейкой между ними.

Раствор, заполняющий патч-пипетку, может соответствовать ионному составу раствора ванны, как в случае записи прикрепленных к клеткам, или соответствовать цитоплазме для записи целых клеток. Раствор в растворе ванны может соответствовать физиологическому внеклеточному раствору, цитоплазме или быть полностью нефизиологическим, в зависимости от проводимого эксперимента. Исследователь также может изменить состав раствора в ванне (или, реже, раствора из пипетки), добавляя ионы или лекарства для изучения ионных каналов в различных условиях.

В зависимости от того, что исследователь пытается измерить, диаметр используемого наконечника пипетки может варьироваться, но обычно он находится в диапазоне микрометров . ^[2] Этот небольшой размер используется для ограждения области поверхности клеточной мембраны или «участка», который часто содержит только одну или несколько молекул ионного канала. ^[3] Этот тип электрода отличается от «острого микроэлектрода», используемого для прокалывания клеток в традиционных внутриклеточных записях , тем, что он прикрепляется к поверхности клеточной мембраны, а не вставляется сквозь нее.

В некоторых экспериментах кончик микропипетки нагревают в микроковке для получения гладкой поверхности, которая способствует формированию высокопрочного соединения с клеточной мембраной. Чтобы получить это уплотнение с высоким сопротивлением, микропипетку прижимают к клеточной мембране и применяют отсасывание. Часть клеточной мембраны всасывается в пипетку, создавая омега -образную область мембраны, которая при правильном формировании создает сопротивление в диапазоне 10–100 гигаом , называемое «гигаомным уплотнением» или «гигапечатью». ^[3] Высокое сопротивление этого уплотнения позволяет электронно изолировать токи, измеренные через мембранную заплату, с небольшим конкурирующим шумом ., а также обеспечивает некоторую механическую стабильность записи. ^[4]

Запись

Многие усилители с патч-фиксацией не используют истинную схему фиксации напряжения , а вместо этого представляют собой дифференциальные усилители , в которых используется электрод ванны для установки уровня нулевого тока (земли). Это позволяет исследователю поддерживать постоянное напряжение, наблюдая за изменениями тока . Чтобы сделать эти записи, патч-пипетку сравнивают с заземляющим электродом. Затем в систему подается ток для поддержания постоянного заданного напряжения. Ток, необходимый для фиксации напряжения, противоположен по знаку и равен по величине току через мембрану. ^[3]

В качестве альтернативы, ячейку можно фиксировать по току в режиме целой клетки, поддерживая постоянный ток при наблюдении за изменениями напряжения на мембране . ^[5]

Вариации

В зависимости от того, что исследователь хочет изучить, можно применять несколько вариантов базовой техники. Методы наизнанку и наружу называются методами «вырезанного участка», потому что участок вырезается (удаляется) из основного тела клетки. Для изучения поведения отдельных ионных каналов в секции мембраны, прикрепленной к электроду, используются метод прикрепления клеток и метод иссечения пластыря.

Заплата с цельной ячейкой и перфорированная заплата позволяют исследователю изучать электрическое поведение всей клетки, а не токов одного канала. Заплата для всей клетки, которая обеспечивает электрический доступ с низким сопротивлением внутрь клетки, в настоящее время в значительной степени заменила методы записи микроэлектродов с высоким сопротивлением для регистрации токов через всю клеточную мембрану.

Патч, прикрепленный к ячейке

Для этого метода пипетку припаивают к клеточной мембране, чтобы получить гигасеаль (уплотнение с электрическим сопротивлением порядка гигаома), при этом клеточная мембрана остается неповрежденной. Это позволяет регистрировать токи через один или несколько ионных каналов, содержащихся в участке мембраны, захваченном пипеткой. Прикрепляясь только к внешней стороне клеточной мембраны, клеточная структура практически не нарушается. ^[3] Кроме того, не разрушая внутреннюю часть клетки, любые внутриклеточные механизмы, в норме влияющие на канал, по-прежнему смогут функционировать так, как они физиологически. ^[6] Используя этот метод, также относительно легко получить правильную конфигурацию, и однажды полученная она довольно стабильна. ^[7]

Для лигандзависимых ионных каналов или каналов, которые модулируются метаботропными рецепторами , изучаемый нейротрансмиттер или лекарство обычно включают в раствор пипетки, где он может взаимодействовать с тем, что раньше было внешней поверхностью мембраны. Результирующая активность канала может быть связана с используемым лекарством, хотя обычно невозможно изменить концентрацию лекарства внутри пипетки. Таким образом, метод ограничен одной точкой на кривой доза-эффект на пластырь. Таким образом, дозозависимая реакция достигается с использованием нескольких клеток и пластырей. Однако потенциалзависимые ионные каналымогут быть последовательно зажаты при разных мембранных потенциалах в одном пластыре. Это приводит к активации канала в зависимости от напряжения, и полная кривая ВАХ (вольтамперная характеристика) может быть получена только на одном патче. Другим потенциальным недостатком этого метода является то, что, поскольку внутриклеточные пути клетки не нарушаются, их также нельзя напрямую модифицировать. ^[7]

Патч наизнанку

При методе наизнанку участок мембраны прикрепляют к пипетке, отделяют от остальной части клетки, и цитозольную поверхность мембраны подвергают воздействию внешней среды или ванны. ^[8] Одним из преимуществ этого метода является то, что экспериментатор имеет доступ к внутриклеточной поверхности мембраны через ванну и может изменить химический состав того, чему подвергается внутренняя поверхность мембраны. Это полезно, когда экспериментатор хочет манипулировать средой на внутриклеточной поверхности одиночных ионных каналов. Например, каналы, которые активируются внутриклеточными лигандами, затем можно изучать в диапазоне концентраций лиганда.

Для достижения конфигурации «изнутри-наружу» пипетку прикрепляют к клеточной мембране, как и в режиме прикрепления к клетке, образуя гигасеаль, а затем втягивают, чтобы оторвать участок мембраны от остальной части клетки. Снятие мембранной заплаты часто вначале приводит к образованию мембранной везикулы на кончике пипетки, потому что концы мембранной заплаты быстро сливаются после иссечения. Затем внешняя поверхность пузырька должна быть вскрыта, чтобы войти в режим «наизнанку»; это можно сделать, ненадолго пропустив мембрану через границу раздела раствор/воздух в ванне, подвергнув ее воздействию раствора с низким содержанием Ca 2+ или мгновенным контактом с каплей парафина или кусочком отвержденного силиконового полимера.^[9]

Запись целых клеток или пластырь целых клеток

Запись целых клеток включает запись токов по нескольким каналам одновременно на большой области клеточной мембраны. Электрод остается на ячейке, как и в записи, прикрепленной к клетке, но для разрыва мембранного участка применяется большее отсасывание, что обеспечивает доступ изнутри пипетки к внутриклеточному пространству клетки. Это обеспечивает средства для введения и изучения того, как лечение (например, лекарства) может влиять на клетки в режиме реального времени. ^[10]После прикрепления пипетки к клеточной мембране пластырь можно снять двумя способами. Во-первых, применяя больше всасывания. Количество и продолжительность этого всасывания зависит от типа клеток и размера пипетки. Другой метод требует подачи большого импульса тока через пипетку. Сила тока и длительность импульса также зависят от типа ячейки. ^[7] Для некоторых типов клеток удобно применять оба метода одновременно для разрыва заплаты.

Преимущество записи патч-клампой цельной клетки по сравнению с записью методом острого электрода заключается в том, что большее отверстие на кончике электрода патч-клампы обеспечивает более низкое сопротивление и, следовательно, лучший электрический доступ к внутренней части клетки. ^{[11] [10]} Недостатком этого метода является то, что, поскольку объем электрода больше, чем объем клетки, растворимое содержимое внутри клетки будет медленно замещаться содержимым электрода. Это называется электродом, «диализирующим» содержимое клетки. ^[7] Через некоторое время любые свойства клетки, зависящие от растворимого внутриклеточного содержимого, изменятся. Используемый раствор пипетки обычно приближается к раствору с высоким содержанием калия .среды внутренней части клетки, чтобы свести к минимуму любые изменения, которые это может вызвать. Часто в начале записи целой клетки есть период, когда можно проводить измерения до того, как клетка подверглась диализу. ^[7]

Патч снаружи наружу

Название «изнутри-наружу» подчеркивает как комплементарность этого метода методу «изнутри-наружу», так и тот факт, что он помещает внешнюю, а не внутриклеточную поверхность клеточной мембраны снаружи участка мембраны по отношению к накладному электроду. . ^[6]

Формирование внешнего участка начинается с конфигурации записи всей клетки. После того, как сформирована цельноклеточная конфигурация, электрод медленно извлекают из клетки, позволяя пузырю мембраны выйти из клетки. Когда электрод оттянут достаточно далеко, этот пузырь отделится от клетки и превратится в выпуклую мембрану на конце электрода (подобно шару, открытому на кончике электрода), при этом исходная внешняя часть мембраны будет обращена наружу. электрод. ^[6]Как показано на изображении справа, это означает, что жидкость внутри пипетки будет имитировать внутриклеточную жидкость, в то время как исследователь может свободно перемещать пипетку и пузырь с ее каналами в другую ванну с раствором. Хотя в пузыре мембраны может существовать несколько каналов, в этой конформации также возможны одноканальные записи, если пузырек отслоившейся мембраны мал и содержит только один канал. ^[12]

Заделка снаружи наружу дает экспериментатору возможность исследовать свойства ионного канала, когда он изолирован от клетки и подвергается последовательному воздействию различных растворов на внеклеточной поверхности мембраны. Экспериментатор может наполнить один и тот же пластырь различными растворами за относительно короткое время, и если канал активируется нейротрансмиттером или лекарством из внеклеточной поверхности лица, то можно получить кривую доза-реакция . ^[13]Эта способность измерять ток через один и тот же участок мембраны в разных растворах является явным преимуществом пластыря снаружи наружу по сравнению с методом прикрепления клеток. С другой стороны, выполнить его сложнее. Более длительный процесс формирования включает в себя больше шагов, которые могут привести к сбою, и приводит к меньшей частоте использования исправлений.

Перфорированный патч

Этот вариант метода патч-кламп очень похож на цельноклеточную конфигурацию. Основное отличие состоит в том, что при формировании гигаомного уплотнения экспериментатор не использует отсасывание для разрыва мембраны заплаты. Вместо этого электродный раствор содержит небольшое количество противогрибкового или антибиотического агента, такого как амфотерицин-В , нистатин или грамицидин , который диффундирует в участок мембраны и образует небольшие поры в мембране, обеспечивая электрический доступ к внутренней части клетки. ^[14]Сравнивая методы цельноклеточного и перфорированного пластыря, можно представить цельноклеточный пластырь как открытую дверь, в которой происходит полный обмен между молекулами в растворе пипетки и цитоплазмой. Перфорированное пятно можно уподобить сетчатой ​​двери, которая позволяет только некоторым молекулам из пипеточного раствора перемещаться в цитоплазму клетки.

Преимущества метода перфорированного пластыря по сравнению с записью целых клеток включают свойства пор антибиотика, которые позволяют уравновешивать только небольшие одновалентные ионы между пипеткой-пластырем и цитозолем, но не более крупные молекулы, которые не могут проникнуть через поры. Это свойство поддерживает эндогенные уровни двухвалентных ионов, таких как Ca ²⁺ , и сигнальных молекул, таких как цАМФ . Следовательно, можно получить записи всей клетки, как при зажиме участка цельной клетки, сохраняя при этом большинство внутриклеточных сигнальных механизмов, как в записях, прикрепленных к клетке. В результате уменьшается текущий износ, а стабильные записи перфорированных патчей могут длиться более одного часа. ^[14]Недостатки включают более высокое сопротивление доступа по сравнению с целой клеткой из-за частичной мембраны, занимающей кончик электрода. Это может снизить текущее разрешение и увеличить шум записи. Антибиотику также может потребоваться значительное время для перфорации мембраны (около 15 минут для амфотерицина-В и еще больше для грамицидина и нистатина). Мембрана под наконечником электрода ослаблена перфорациями, образованными антибиотиком, и может разорваться. Если пластырь разрывается, запись осуществляется в режиме целой клетки, при этом антибиотик загрязняет внутреннюю часть клетки. ^[14]

Свободный патч

Свободный накладной зажим отличается от других методов, обсуждаемых здесь, тем, что в нем используется свободное уплотнение (низкое электрическое сопротивление), а не тугое уплотнение, используемое в традиционной технике. Этот метод использовался еще в 1961 году, как описано в статье Стрикхольма об импедансе поверхности мышечной клетки ^[15] , но ему уделялось мало внимания, пока он снова не был поднят и назван Алмерсом, Стэнфилдом и Штюмером. в 1982 г. ^[16] после того, как патч-клэмп стал основным инструментом электрофизиологии.

Чтобы получить свободный зажим на клеточной мембране, пипетку медленно перемещают к клетке до тех пор, пока электрическое сопротивление контакта между клеткой и пипеткой не станет в несколько раз больше, чем сопротивление одного только электрода. Чем ближе пипетка подходит к мембране, тем больше становится сопротивление наконечника пипетки, но если образуется слишком близкое уплотнение, может быть трудно удалить пипетку, не повредив ячейку. В технике незакрепленного пластыря пипетка не подходит достаточно близко к мембране, чтобы образовать гигасеаль или постоянное соединение, а также для того, чтобы проколоть клеточную мембрану. ^[17] Мембрана клетки остается неповрежденной, а отсутствие герметичности создает небольшой зазор, через который ионы могут проходить за пределы клетки, не попадая в пипетку.

Существенным преимуществом незакрепленного уплотнения является то, что используемую пипетку можно повторно снять с мембраны после записи, при этом мембрана останется неповрежденной. Это позволяет проводить повторные измерения в различных местах одной и той же клетки без нарушения целостности мембраны. Эта гибкость была особенно полезна исследователям для изучения мышечных клеток, поскольку они сокращаются в реальных физиологических условиях, быстро получая записи и делая это, не прибегая к решительным мерам, чтобы остановить сокращение мышечных волокон. ^[16]Основным недостатком является то, что сопротивление между пипеткой и мембраной значительно снижается, что позволяет току просачиваться через уплотнение и значительно снижает разрешение малых токов. Однако эту утечку можно частично скорректировать, что дает возможность сравнить и сопоставить записи, сделанные из разных областей интересующей ячейки. Учитывая это, было подсчитано, что метод свободной заплаты может разрешать токи менее 1 мА/см ² . ^[17]

Patch-Seq

Этот метод , сочетающий в себе клеточную визуализацию, секвенирование РНК и пэтч-клэмп , используется для полной характеристики нейронов в различных модальностях. ^[18] Поскольку нервные ткани представляют собой одну из наиболее транскриптомически разнообразных популяций клеток , классификация нейронов по типам клеток для понимания образуемых ими цепей является серьезной проблемой для неврологов. Сочетание классических методов классификации с апостериорным секвенированием РНК одной клетки оказалось трудным и медленным. Путем объединения нескольких модальностей данных, таких как электрофизиология , секвенирование и микроскопия, Patch-seq позволяет одновременно охарактеризовать нейроны несколькими способами. В настоящее время он страдает от низкой пропускной способности по сравнению с другими методами секвенирования, в основном из-за ручного труда, необходимого для достижения успешной записи патч-зажима на нейроне. В настоящее время ведутся исследования по автоматизации технологии patch-clamp, которая также повысит производительность patch-seq. ^[19]

Автоматический зажим патча

Для недорогого сбора больших объемов данных за более короткий период времени были разработаны автоматизированные системы патч-фиксации . Такие системы обычно включают одноразовое микрожидкостное устройство, либо отлитое под давлением , либо литой чип из полидиметилсилоксана (ПДМС) для захвата клетки или клеток, а также встроенный электрод.

В одной из форм такой автоматизированной системы используется перепад давления, чтобы заставить исследуемые клетки подтягиваться к отверстию пипетки до тех пор, пока они не сформируют гигасейл. Затем при кратковременном воздействии атмосферы на наконечник пипетки часть мембраны, выступающая из пипетки, лопается, и теперь мембрана находится в конформации наизнанку на кончике пипетки. В полностью автоматизированной системе пипетку и мембранный пластырь можно быстро перемещать через ряд различных тестовых растворов, что позволяет наносить различные тестовые соединения на внутриклеточную сторону мембраны во время записи. ^[19]

Смотрите также

использованная литература

внешняя ссылка

• Альтернативные изображения для вариантов патч-клеммы
• Анимация метода патч-клэмп