Гель-электрофорез в импульсном поле - это метод, используемый для разделения больших молекул ДНК путем приложения к гелевой матрице электрического поля, которое периодически меняет направление. [1] [2]
Историческое прошлое
Стандартные методы гель-электрофореза для разделения молекул ДНК предоставили огромные преимущества для исследований в области молекулярной биологии. Однако он не смог эффективно разделить очень большие молекулы ДНК. Молекулы ДНК размером более 15–20 т.п.н., мигрирующие через гель, будут перемещаться вместе независимо от размера. В 1984 году в Колумбийском университете Дэвид Шварц и Чарльз Кантор разработали вариант стандартного протокола, введя переменный градиент напряжения для улучшения разрешения более крупных молекул. [3] Этот метод получил название гель-электрофореза в импульсном поле (PFGE). Разработка PFGE расширила диапазон разрешения для фрагментов ДНК на два порядка.
Процедура
Процедура этого метода относительно аналогична выполнению стандартного гель-электрофореза, за исключением того, что вместо того, чтобы постоянно пропускать напряжение в одном направлении, напряжение периодически переключается между тремя направлениями; одна проходит через центральную ось геля, а две проходят под углом 60 градусов с каждой стороны. Время импульсов одинаково для каждого направления, что приводит к чистой прямой миграции ДНК. Для очень больших молекул (примерно до 2 Мбит / с) можно использовать линейные изменения интервала переключения, которые увеличивают время импульса для каждого направления в течение нескольких часов - например, возьмем линейное увеличение импульса с 10 секунд при 0 часов до 60 секунд в 18 часов.
Эта процедура занимает больше времени, чем обычный гель-электрофорез из-за размера разделяемых фрагментов и того факта, что ДНК не движется по прямой линии через гель.
Теория
В то время как в целом небольшие фрагменты могут проходить через матрицу геля легче, чем большие фрагменты ДНК, существует пороговая длина более 30–50 т.п. группа.
Однако при периодическом изменении направления поля ДНК различной длины реагируют на изменение с разной скоростью. То есть более крупные фрагменты ДНК будут медленнее перестраивать свой заряд при изменении направления поля, в то время как более мелкие фрагменты будут быстрее. С течением времени при последовательном изменении направлений каждая полоса начнет отделяться все больше и больше даже на очень больших участках. Таким образом, становится возможным разделение очень больших фрагментов ДНК с помощью PFGE.
Приложения
PFGE можно использовать для генотипирования или генетического снятия отпечатков пальцев . В течение нескольких десятилетий это обычно считалось золотым стандартом в эпидемиологических исследованиях патогенных организмов. Например, определение подтипов бактериальных изолятов с помощью этого метода облегчило различение штаммов Listeria monocytogenes и, таким образом, установление связи между экологическими или пищевыми изолятами с клиническими инфекциями. Сейчас он заменяется методами секвенирования нового поколения. [4]
Смотрите также
Рекомендации
- ^ Кауфманн, Мэри Элизабет (1998). «Гель-электрофорез в импульсном поле». Молекулярная бактериология . Методы молекулярной медицины. 15 . С. 33–50. DOI : 10.1385 / 0-89603-498-4: 33 . ISBN 0-89603-498-4. PMID 21390741 .
- ^ Хершлеб, Джилл; Ананьев, Гена; Шварц, Дэвид C (март 2007 г.). «Гель-электрофорез в импульсном поле». Протоколы природы . 2 (3): 677–684. DOI : 10.1038 / nprot.2007.94 . PMID 17406630 . S2CID 13265518 .
- ^ Шварц, округ Колумбия, Кантор CR (май 1984 г.). «Разделение дрожжевой ДНК размером с хромосому с помощью гель-электрофореза в градиенте импульсного поля» . Cell . 37 (1): 67–75. DOI : 10.1016 / 0092-8674 (84) 90301-5 . PMID 6373014 .
- ^ Ribot, Efrain M .; Фриман, Молли; Хайз, Келли Б.; Гернер-Шмидт, Питер (июль 2019 г.). «PulseNet: вступая в эру секвенирования следующего поколения» . Пищевые патогены и болезни . 16 (7): 451–456. DOI : 10.1089 / fpd.2019.2634 . PMC 6653803 . PMID 31241352 .
Внешние ссылки
- Метод импульсного поля
- Прикладная математика BioNumerics PFGE typing