Из Википедии, свободной энциклопедии
  (Перенаправлено с электрофореза ДНК )
Перейти к навигации Перейти к поиску
Цифровая распечатка электрофореза в агарозном геле кошки- вставки плазмидной ДНК
След электрофореграммы ДНК

Электрофорез нуклеиновой кислоты - это аналитический метод, используемый для разделения фрагментов ДНК или РНК по размеру и реакционной способности. Молекулы нуклеиновой кислоты, которые должны быть проанализированы, помещаются в вязкую среду, гель , где электрическое поле заставляет нуклеиновые кислоты (которые имеют отрицательный заряд из-за их сахарно- фосфатной основы) мигрировать к аноду (который заряжен положительно, потому что это скорее электролитический , чем гальванический элемент). Разделение этих фрагментов достигается за счет использования подвижностей, с которыми молекулы разных размеров могут проходить через гель. Более длинные молекулы перемещаются медленнее, потому что они испытывают большее сопротивление внутри геля. Поскольку размер молекулы влияет на ее подвижность, более мелкие фрагменты оказываются ближе к аноду, чем более длинные за определенный период. Через некоторое время напряжение снимается и анализируется градиент фрагментации. Для больших расстояний между фрагментами одинакового размера можно увеличить напряжение или время работы. Длительные исследования геля низкого напряжения обеспечивают наиболее точное разрешение. Однако напряжение не является единственным фактором при определении электрофореза нуклеиновых кислот.

Подлежащую разделению нуклеиновую кислоту можно получить несколькими способами перед разделением с помощью электрофореза. В случае больших молекул ДНК ДНК часто разрезают на более мелкие фрагменты с помощью эндонуклеазы рестрикции ДНК (или рестрикционного фермента). В других случаях, таких как образцы, амплифицированные ПЦР , ферменты, присутствующие в образце, которые могут повлиять на разделение молекул, удаляются различными способами перед анализом. После того, как нуклеиновая кислота приготовлена ​​должным образом, образцы раствора нуклеиновой кислоты помещают в лунки геля, и к гелю прикладывают напряжение в течение определенного времени.

Фрагменты ДНК разной длины визуализируются с помощью флуоресцентного красителя, специфичного для ДНК, такого как бромид этидия . Гель показывает полосы, соответствующие различным популяциям молекул нуклеиновых кислот с разной молекулярной массой. Размер фрагмента обычно указывается в «нуклеотидах», «парах оснований» или «kb» (для тысяч пар оснований) в зависимости от того, была ли разделена одно- или двухцепочечная нуклеиновая кислота. Определение размера фрагмента обычно проводят путем сравнения с коммерчески доступными ДНК-маркерами, содержащими линейные фрагменты ДНК известной длины.

Типы гелей, наиболее часто используемых для электрофореза нуклеиновых кислот, - это агароза (для относительно длинных молекул ДНК) и полиакриламид (для высокого разрешения коротких молекул ДНК, например, при секвенировании ДНК ). Гели обычно используют в «пластинчатом» формате, таком как показано на рисунке, но капиллярный электрофорез стал важным для таких приложений, как высокопроизводительное секвенирование ДНК. Методы электрофореза, используемые при оценке повреждения ДНК, включают электрофорез в щелочном геле и гель-электрофорез в импульсном поле .

Для коротких сегментов ДНК, таких как двухцепочечная ДНК от 20 до 60 п.н., обработка их в полиакриламидном геле (PAGE) даст лучшее разрешение (нативное состояние). [1] Точно так же РНК и одноцепочечную ДНК можно запускать и визуализировать с помощью гелей для ПААГ, содержащих денатурирующие агенты, такие как мочевина. Гели для ПААГ широко используются в таких методах, как печать стопы ДНК, EMSA и другие методы взаимодействия ДНК с белками.

Измерение и анализ в основном выполняются с помощью специального программного обеспечения для анализа гелей. Результаты капиллярного электрофореза обычно отображаются в виде графика, называемого электрофореграммой .

Факторы, влияющие на миграцию нуклеиновых кислот [ править ]

На миграцию нуклеиновых кислот может влиять ряд факторов: размер пор геля, используемое напряжение, ионная сила буфера и концентрация интеркалирующего красителя, такого как бромистый этидий, если он используется во время электрофореза. [2]

Размер ДНК [ править ]

Гель просеивает ДНК по размеру молекулы ДНК, благодаря чему более мелкие молекулы перемещаются быстрее. Двухцепочечная ДНК движется со скоростью, которая приблизительно обратно пропорциональна логарифму числа пар оснований. Однако это соотношение нарушается с очень большими фрагментами ДНК, и их невозможно разделить с помощью стандартного электрофореза в агарозном геле . Предел разрешения зависит от состава геля и напряженности поля. [3], и на подвижность более крупной кольцевой ДНК может сильнее влиять размер пор геля, чем на линейную ДНК. [4] Разделение очень больших фрагментов ДНК требует гель-электрофореза в импульсном поле.(PFGE). В гель-электрофорезе с инверсией поля (FIGE, разновидность PFGE) возможна «инверсия полосы», когда большие молекулы могут двигаться быстрее, чем маленькие.

Гели препаратов плазмид обычно показывают основную полосу суперспиральной ДНК с другими более слабыми полосами на той же полосе. Обратите внимание, что обычно гель ДНК отображается с меньшими фрагментами ДНК около дна геля. Это связано с тем, что исторически гель ДНК запускался вертикально, и более мелкие фрагменты ДНК перемещались вниз быстрее.

Конформация ДНК [ править ]

Конформации молекулы ДНК могут существенно влиять на движении ДНК, например, суперспирализовано ДНК , как правило , двигается быстрее , чем расслабленный ДНК , поскольку она плотно спиральная и , следовательно , более компактным. В нормальном препарате плазмидной ДНК могут присутствовать несколько форм ДНК, [5] и гель от электрофореза плазмид обычно показывает основную полосу, которая будет отрицательно свернутой формой, в то время как другие формы ДНК могут выглядеть как второстепенные, более слабые. группы. Эти второстепенные полосы могут быть ДНК с разрывами (открытая круговая форма) и расслабленной закрытой круговой формой, которая обычно работает медленнее, чем суперспиральная ДНК., а одноцепочечная форма (которая иногда может появляться в зависимости от методов получения) может двигаться впереди суперспиральной ДНК. Однако скорость, с которой перемещаются различные формы, может изменяться при использовании различных условий электрофореза, например, линейная ДНК может работать быстрее или медленнее, чем суперспиральная ДНК, в зависимости от условий [6], а подвижность более крупной кольцевой ДНК может быть более сильно затронута, чем линейная ДНК. размером пор геля. [4] Если не используются маркеры суперспиральной ДНК , размер кольцевой ДНК-подобной плазмиды может быть более точно определен после того, как она была линеаризована рестрикционным гидролизом .

Повреждение ДНК из-за повышенного сшивания также снижает электрофоретическую миграцию ДНК в зависимости от дозы. [7] [8]

Концентрация бромистого этидия [ править ]

На кольцевую ДНК сильнее влияет концентрация бромида этидия, чем на линейную ДНК, если бромид этидия присутствует в геле во время электрофореза. Все естественные круги ДНК скручены, но бромид этидия, который интеркалирует в кольцевую ДНК, может изменять заряд, длину, а также суперсильность молекулы ДНК, поэтому его присутствие во время электрофореза может повлиять на ее движение в геле. Увеличение количества бромида этидия, интеркалированного в ДНК, может превратить ее из отрицательно свернутой в спираль молекулы в полностью расслабленную форму, а затем в положительно свернутую суперспираль при максимальной интеркаляции. [9] Электрофорез в агарозном геле можно использовать для разделения кольцевой ДНК с различной топологией суперспирализации.

Концентрация геля [ править ]

Концентрация геля определяет размер пор геля, который влияет на миграцию ДНК. Разрешение ДНК изменяется в зависимости от процентной концентрации геля. Увеличение концентрации агарозы в геле снижает скорость миграции и улучшает разделение более мелких молекул ДНК, в то время как снижение концентрации геля позволяет разделить большие молекулы ДНК. Для стандартного электрофореза в агарозном геле 0,7% дает хорошее разделение или разрешение больших фрагментов ДНК размером 5–10 килобайт, а 2% гель дает хорошее разрешение для небольших фрагментов размером 0,2–1 килобайт. До 3% можно использовать для разделения очень мелких фрагментов, но для вертикального полиакриламидного геля.больше подходит для разрешения мелких фрагментов. Однако гель с высокой концентрацией требует более длительного времени работы (иногда дней), а гели с высоким процентным содержанием часто бывают хрупкими и не могут схватываться равномерно. Гели с высоким процентным содержанием агарозы следует запускать с PFGE или FIGE. Гели с низким процентным содержанием (0,1-0,2%) хрупкие и могут сломаться. 1% гели широко используются во многих областях. [10]

Применяемое поле [ править ]

При низких напряжениях скорость миграции ДНК пропорциональна приложенному напряжению, т. Е. Чем выше напряжение, тем быстрее движется ДНК. Однако с увеличением напряженности электрического поля подвижность высокомолекулярных фрагментов ДНК дифференциально возрастает, и эффективный диапазон разделения уменьшается, и поэтому разрешение уменьшается при высоком напряжении. Для оптимального разрешения ДНК размером более 2 КБ при стандартном гель-электрофорезе рекомендуется от 5 до 8 В / см. [6] Напряжение также ограничено тем фактом, что оно нагревает гель и может вызвать плавление геля, если гель работает под высоким напряжением в течение длительного периода, особенно для геля агарозы с низкой температурой плавления.

Однако подвижность ДНК может изменяться в неустойчивом поле. В поле, которое периодически меняют, подвижность ДНК определенного размера может значительно снизиться при определенной частоте циклов. [11] Это явление может привести к инверсии полосы, в результате чего более крупные фрагменты ДНК перемещаются быстрее, чем более мелкие в PFGE.

Механизм миграции и отделения [ править ]

Отрицательный заряд фосфатного остова перемещает ДНК к положительно заряженному аноду во время электрофореза. Однако миграция молекул ДНК в растворе в отсутствие гелевой матрицы не зависит от молекулярной массы во время электрофореза, т.е. без гелевой матрицы невозможно разделение по размеру. [12] Гидродинамическое взаимодействие между различными частями ДНК прерывается потоком противоионов, движущихся в противоположном направлении, поэтому не существует механизма для создания зависимости скорости от длины в масштабе, превышающем длину экранирования около 10 нм. [11] Это отличает его от других процессов, таких как седиментация или диффузия, где важно гидродинамическое взаимодействие на больших расстояниях.

Таким образом, гелевая матрица отвечает за разделение ДНК по размеру во время электрофореза, однако точный механизм, ответственный за разделение, не совсем ясен. Существует ряд моделей механизма разделения биомолекул в гелевой матрице, широко распространенной является модель Огстона, которая рассматривает полимерную матрицу как сито, состоящее из случайно распределенной сети связанных между собой пор. [13] Глобулярный белок или случайная спираль ДНК движется через соединенные поры, достаточно большие, чтобы приспособиться к его прохождению, и движение более крупных молекул с большей вероятностью будет затруднено и замедлено из-за столкновений с гелевой матрицей и молекулами разных Таким образом, в процессе просеивания можно разделить размеры. [11]

Однако модель Огстона не работает для больших молекул, в результате чего поры значительно меньше размера молекулы. Для молекул ДНК размером более 1 т.п.н. чаще всего используется модель рептации (или ее варианты). Эта модель предполагает, что ДНК может ползать «змееподобным» образом (отсюда и «рептация») через поры в виде удлиненной молекулы. При более высокой напряженности электрического поля это превратилось в смещенную модель отражения, в результате чего передний конец молекулы сильно смещен в прямом направлении, и этот передний край тянет за собой остальную часть молекулы. В режиме полного смещения подвижность достигла точки насыщения, и ДНК сверх определенного размера не может быть отделена. [13] Однако идеальное параллельное выравнивание цепи с полем на практике не наблюдается, поскольку это означало бы одинаковую подвижность для длинных и коротких молекул. [11] Дальнейшее уточнение модели смещения рептаций учитывает внутренние колебания цепи. [14]

Смещенная модель рептации также использовалась для объяснения подвижности ДНК в PFGE. Ориентация ДНК постепенно создается рептацией после начала действия поля, и время, в течение которого она достигает установившейся скорости, зависит от размера молекулы. Когда поле изменяется, более крупным молекулам требуется больше времени для переориентации, поэтому можно отличить длинные цепи, которые не могут достичь своей установившейся скорости, от коротких, которые большую часть времени перемещаются с постоянной скоростью. [14] Однако существуют и другие модели.

Флуоресцентная микроскопия окрашенных молекул в реальном времени показала более тонкую динамику во время электрофореза, при этом ДНК проявляла значительную эластичность, поскольку она попеременно растягивалась в направлении приложенного поля, а затем сжималась в шар или зацеплялась в U-образную форму, когда она зацепились за полимерные волокна. [15] [16] Это наблюдение можно назвать «гусеничной» моделью. [17] Другая модель предполагает, что ДНК запутывается с полимерной матрицей, и чем больше молекула, тем больше вероятность, что она запутается и ее движение будет затруднено. [18]

Визуализация [ править ]

ДНК-гель-электрофорез

Наиболее распространенным красителем, используемым для того, чтобы сделать полосы ДНК или РНК видимыми для электрофореза в агарозном геле, является бромид этидия , обычно сокращенно EtBr. Он флуоресцирует в ультрафиолетовом свете при внедрении в большую бороздку ДНК (или РНК). Если пропустить ДНК через гель, обработанный EtBr, и визуализировать ее в УФ-свете, любая полоса, содержащая более ~ 20 нг ДНК, становится отчетливо видимой. EtBr является известным мутагеном , [19] и более безопасные альтернативы, такие как GelRed , производимого Biotium , который связывается с малой бороздкой. [20]

SYBR Green I - еще один краситель дцДНК, производимый Invitrogen . Он дороже, но в 25 раз более чувствителен и, возможно, безопаснее, чем EtBr, хотя нет данных, касающихся его мутагенности или токсичности для людей. [21]

SYBR Safe - это вариант SYBR Green, который, как было доказано, имеет достаточно низкие уровни мутагенности и токсичности, чтобы считаться неопасными отходами в соответствии с федеральными правилами США. [22] Он имеет те же уровни чувствительности, что и EtBr, [22], но, как и SYBR Green, значительно дороже. Однако в странах, где безопасная утилизация опасных отходов является обязательной, затраты на утилизацию EtBr могут легко превысить первоначальную разницу в цене.

Поскольку окрашенная EtBr ДНК не видна в естественном свете, ученые смешивают ДНК с отрицательно заряженными загрузочными буферами перед добавлением смеси в гель. Буферы загрузки полезны, потому что они видны в естественном свете (в отличие от УФ-света для ДНК, окрашенной EtBr), и они осаждаются совместно с ДНК (что означает, что они движутся с той же скоростью, что и ДНК определенной длины). Ксилолцианол и бромфеноловый синий - распространенные красители, содержащиеся в загрузочных буферах; они работают примерно с той же скоростью, что и фрагменты ДНК длиной 5000 и 300 пар оснований соответственно, но точное положение зависит от процентного содержания геля. Другими менее часто используемыми маркерами прогресса являются Cresol Red и Orange G. которые составляют примерно 125 и 50 п.н. соответственно.

Визуализации также можно добиться путем переноса ДНК после SDS-PAGE на нитроцеллюлозную мембрану с последующим воздействием гибридизационного зонда . Этот процесс называется саузерн-блоттингом .

В случае флуоресцентных красителей после электрофореза гель освещают ультрафиолетовой лампой (обычно помещая ее в световой короб и используя защитное снаряжение для ограничения воздействия ультрафиолетового излучения). Устройство освещения в основном также содержит устройство формирования изображения, которое делает изображение геля после освещения УФ-излучением. Этидийбромид флуоресцируеткрасновато-оранжевый в присутствии ДНК, поскольку он интеркалирован с ДНК. Полосу ДНК можно также вырезать из геля и затем растворить для извлечения очищенной ДНК. Затем гель можно сфотографировать, как правило, с помощью цифровой или поляроидной камеры. Хотя окрашенная нуклеиновая кислота имеет красновато-оранжевый цвет, изображения обычно отображаются в черно-белом цвете (см. Рисунки). Повреждение образца ДНК ультрафиолетом может снизить эффективность последующих манипуляций с образцом, таких как лигирование и клонирование. Ультрафиолетовое излучение с более короткой длиной волны (302 или 312 нм) вызывает больший ущерб, например, воздействие всего за 45 секунд может значительно снизить эффективность преобразования.. Поэтому, если ДНК будет использоваться для последующих процедур, следует ограничить воздействие ультрафиолетового излучения с более короткой длиной волны, вместо этого следует использовать ультрафиолетовое излучение с более высокой длиной волны (365 нм), которое причиняет меньше повреждений. Однако излучение с более высокой длиной волны дает более слабую флуоресценцию, поэтому, если необходимо захватить изображение геля, можно использовать более коротковолновый УФ-свет в течение короткого времени. Добавление цитидина или гуанозина в буфер для электрофореза в концентрации 1 мМ может защитить ДНК от повреждения. [23] В качестве альтернативы можно использовать источник возбуждения синего света с возбуждаемым синим пятном, такой как SYBR Green или GelGreen .

При исследовании гель-электрофореза часто используются программные инструменты анализа изображений, такие как ImageJ .

123
Пластинчатый гель с 1% агарозы при нормальном освещении за УФ-экраном из плексигласа. Видны только маркерные красители
Гель с УФ-освещением, ДНК, окрашенная бромистым этидием, светится оранжевым
Цифровая фотография геля. Дорожка 1. Коммерческие ДНК-маркеры (1kbplus), дорожка 2. пустая, дорожка 3. ПЦР- продукт, содержащий чуть более 500 оснований, дорожка 4. Рестрикционный гидролизат, показывающий аналогичный фрагмент, вырезанный из плазмидного вектора размером 4,5 т.п.н.

Ссылки [ править ]

  1. ^ Jaguva Васудеван, Ананда айяппа; Марио Перкович; Янник Буллиард; Клаус Чичутек; Дидье Троно; Дитер Хойссингер; Карстен Мюнк (август 2013 г.). "Prototype пенистого вируса Bet ухудшает димеризацию и цитозольную растворимость человеческого APOBEC3G" . Журнал вирусологии . 87 (16): 9030–9040. DOI : 10,1128 / JVI.03385-12 . PMC  3754047 . PMID  23760237 .
  2. ^ Г. Люкотт; Ф. Банейкс (1993). Введение в методы молекулярного клонирования . Вили-Блэквелл. п. 32. ISBN 978-0471188490.
  3. ^ Иосиф Sambrook; Дэвид Рассел. «Глава 5, протокол 1». Молекулярное клонирование - лабораторное руководство . 1 (3-е изд.). п. 5.2. ISBN 978-0-87969-577-4.
  4. ^ а б Aaij C, Borst P (1972). «Гель-электрофорез ДНК». Biochim Biophys Acta . 269 (2): 192–200. DOI : 10.1016 / 0005-2787 (72) 90426-1 . PMID 5063906 . 
  5. ↑ Ричард Р. Синден (24 ноября 1994 г.). Структура и функции ДНК . Academic Press Inc. стр. 97. ISBN 978-0126457506.
  6. ^ а б Джозеф Сэмбрук; Дэвид Рассел. «Глава 5, протокол 1». Молекулярное клонирование - лабораторное руководство . 1 (3-е изд.). С. 5.5–5.6. ISBN 978-0-87969-577-4.
  7. ^ Blasiak Дж, Trzeciak А, Malecká-Панас Е, Drzewoski Дж, Wojewódzka М (2000). «Генотоксичность этанола и ацетальдегида in vitro в лимфоцитах человека и клетках слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта». Токсикология in vitro . 14 (4): 287–295. DOI : 10.1016 / S0887-2333 (00) 00022-9 . PMID 10906435 . 
  8. Перейти ↑ Lu Y, Morimoto K (2009). «Связано ли обычное употребление алкоголя со снижением электрофоретической миграции ДНК в лейкоцитах периферической крови у мужчин японцев с дефицитом ALDH2?» . Мутагенез . 24 (4): 303–308. DOI : 10,1093 / mutage / gep008 . PMID 19286920 . 
  9. ^ Donald Voet; Джудит Г. Воет (1995). Биохимия (2-е изд.). Джон Вили и сыновья. С.  877–878 . ISBN 978-0471586517.
  10. ^ «Электрофорез в агарозном геле (основной метод)» . Биологические протоколы . Проверено 23 августа 2011 года .
  11. ^ а б в г Зимм Б. Х., Левен С. Д. (1992). «Проблемы и перспективы теории гель-электрофореза ДНК» (PDF) . Ежеквартальные обзоры биофизики . 25 (2): 171–204. DOI : 10.1017 / s0033583500004662 . PMID 1518924 .  
  12. ^ Роберт В. Олд; Сэнди Б. Примроуз (27 сентября 1994 г.). Принцип манипуляции генами - введение в генную инженерию (5-е изд.). Blackwell Scientific. п. 9 . ISBN 9780632037124.
  13. ^ а б Ли Чжу; Хун Ван (2 марта 2009 г.). «Глава 4 - Генетический анализ в миниатюрных системах электрофореза» . Инь Тянь, Вэй-Чэн; Finehout, Эрин (ред.). Микрофлюидика для биологических приложений . Springer. п. 125. ISBN 978-0-387-09480-9.
  14. ^ a b Жан-Луи Виови (2000). «Электрофорез ДНК и других полиэлектролитов: физические механизмы». Обзоры современной физики . 72 (3): 813–872. Bibcode : 2000RvMP ... 72..813V . DOI : 10.1103 / RevModPhys.72.813 .
  15. Перейти ↑ Smith SB, Aldridge PK, Callis JB (1989). «Наблюдение за отдельными молекулами ДНК, подвергающимися гель-электрофорезу». Наука . 243 (4888): 203–206. Bibcode : 1989Sci ... 243..203S . DOI : 10.1126 / science.2911733 . PMID 2911733 . 
  16. Перейти ↑ Schwartz DC, Koval M (1989). «Конформационная динамика отдельных молекул ДНК при гель-электрофорезе». Природа . 338 (6215): 520–2. Bibcode : 1989Natur.338..520S . DOI : 10.1038 / 338520a0 . PMID 2927511 . 
  17. ^ Дэвид Шихан (2009), Физическая биохимия: принципы и приложения (2-е изд.), Wiley-Blackwell, стр. 181, ISBN 978-0470856031
  18. ^ Forster RE, Херт DG, Chiesl TN, Fredlake CP, Бэррон AE (2009). «Анализ механизма миграции ДНК для применения в капиллярном и микрочиповом электрофорезе» . Электрофорез . 30 (12): 2014–24. DOI : 10.1002 / elps.200900264 . PMC 2762034 . PMID 19582705 .  
  19. ^ Begusová, M; и другие. (2000). «Влияние интеркаляции бромистого этидия на радиочувствительность ДНК». Int J Radiat Biol . 76 (1).
  20. ^ [1]
  21. ^ «SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain» (PDF) . Архивировано из оригинального (PDF) 22 мая 2012 года . Проверено 23 июня 2013 .
  22. ^ a b "SYBR Safe DNA Gel Stain" (PDF) . Архивировано из оригинального (PDF) 07.09.2012 . Проверено 23 июня 2013 .
  23. ^ Gründemann D, Schömig Е. (1996). «Защита ДНК во время препаративного электрофореза в агарозном геле от повреждений, вызванных ультрафиолетом» (PDF) . Биотехнологии . 21 (5): 898–903. DOI : 10.2144 / 96215rr02 . PMID 8922632 . Архивировано из оригинального (PDF) 04 марта 2016 года . Проверено 26 ноября 2017 .