Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Для обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (RT-PCR) см. Полимеразную цепную реакцию обратной транскрипции .
Диаграмма флуоресценции SYBR Green, полученная с помощью ПЦР в реальном времени
Кривая плавления, полученная в конце ПЦР в реальном времени

В режиме реального времени полимеразной цепной реакции ( ПЦР в реальном времени ), также известный как количественная полимеразной цепной реакции ( КПЦР ), является лабораторная методика по молекулярной биологии на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР). Он отслеживает амплификацию целевой молекулы ДНК во время ПЦР (т. Е. В реальном времени), а не в ее конце, как в обычной ПЦР. ПЦР в реальном времени можно использовать количественно (количественная ПЦР в реальном времени) и полуколичественно (т.е. выше / ниже определенного количества молекул ДНК) (полуколичественная ПЦР в реальном времени).

Двумя распространенными методами обнаружения продуктов ПЦР в ПЦР в реальном времени являются (1) неспецифические флуоресцентные красители, которые интеркалируют с любой двухцепочечной ДНК, и (2) специфичные для последовательности ДНК-зонды, состоящие из олигонуклеотидов , меченных флуоресцентным репортером , что позволяет обнаруживать только после гибридизации зонда с его комплементарной последовательностью.

В рекомендациях « Минимум информации для публикации количественных экспериментов с ПЦР в реальном времени» (MIQE) предлагается использовать сокращение qPCR для количественной ПЦР в реальном времени, а RT-qPCR - для обратной транскрипции - qPCR. [1] Акроним «ОТ-ПЦР» обычно обозначает полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией, а не ПЦР в реальном времени, но не все авторы придерживаются этого соглашения. [2]

Фон [ править ]

ПЦР в реальном времени использует флуорофоры для определения уровней экспрессии генов .

Клетки всех организмов регулируют экспрессию генов за счет оборота транскриптов генов (однонитевой РНК ): количество экспрессируемого гена в клетке можно измерить по количеству копий транскрипта РНК этого гена, присутствующего в образце. Для надежного обнаружения и количественной оценки экспрессии гена из небольших количеств РНК необходима амплификация транскрипта гена. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является распространенным методом для амплификации ДНК; для ПЦР на основе РНК образец РНК сначала подвергается обратной транскрипции в комплементарную ДНК (кДНК) с помощью обратной транскриптазы .

Для амплификации небольших количеств ДНК используется та же методология, что и в обычной ПЦР, с использованием матрицы ДНК, по крайней мере, одной пары конкретных праймеров , дезоксирибонуклеотидов , подходящего буферного раствора и термостабильной ДНК-полимеразы . Вещество, помеченное флуорофором , добавляется к этой смеси в термоциклере, который содержит датчики для измерения флуоресценции флуорофора после его возбуждения на требуемой длине волны.позволяя измерить скорость генерации для одного или нескольких конкретных продуктов. Это позволяет измерять скорость образования амплифицированного продукта в каждом цикле ПЦР. Полученные таким образом данные можно проанализировать с помощью компьютерного программного обеспечения для расчета относительной экспрессии гена (или количества копий мРНК ) в нескольких образцах. Количественная ПЦР также может применяться для обнаружения и количественного определения ДНК в образцах для определения присутствия и количества конкретной последовательности ДНК в этих образцах. [3] Это измерение проводится после каждого цикла амплификации, поэтому этот метод называется ПЦР в реальном времени (то есть немедленной или одновременной ПЦР). В случае количественного определения РНК матрицей является комплементарная ДНК.(кДНК), который получают путем обратной транскрипции из рибонуклеиновой кислоты (РНК). В этом случае используется метод количественной RT-PCR или Q-RT-PCR.

Количественная ПЦР и ДНК-микрочипы - это современные методы изучения экспрессии генов . Для измерения количества мРНК использовали более старые методы: дифференциальный дисплей , анализ защиты от РНКазы и нозерн-блоттинг . Нозерн-блоттинг часто используется для оценки уровня экспрессии гена путем визуализации количества транскриптов его мРНК в образце. В этом методе очищенная РНК разделяется электрофорезом в агарозном геле , переносится на твердую матрицу (например, нейлоновую мембрану) и исследуется с помощью специфического зонда ДНК или РНК, который является комплементарным.интересующему гену. Хотя этот метод все еще используется для оценки экспрессии генов, он требует относительно большого количества РНК и предоставляет только качественную или полуколичественную информацию об уровнях мРНК. [4] Ошибки оценки, возникающие из-за различий в методе количественной оценки, могут быть результатом целостности ДНК, эффективности фермента и многих других факторов. По этой причине ряд систем стандартизации (часто называемых методами нормализации) были разработаны. Некоторые из них были разработаны для количественной оценки общей экспрессии гена, но наиболее распространенные нацелены на количественную оценку конкретного изучаемого гена по отношению к другому гену, называемому нормализующим геном, который выбран по почти постоянному уровню экспрессии. Эти гены часто выбирают из генов домашнего хозяйства, поскольку их функции, связанные с основным выживанием клеток, обычно подразумевают конститутивную экспрессию генов . [5] [6] Это позволяет исследователям сообщать соотношение экспрессии интересующих генов, деленное на экспрессию выбранного нормализатора, что позволяет сравнивать первый без фактического знания его абсолютного уровня экспрессии.

Чаще всего используются нормализующие гены, кодирующие следующие молекулы: тубулин , глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа , альбумин , циклофилин и рибосомные РНК . [4]

Основные принципы [ править ]

Основная статья: Полимеразная цепная реакция

ПЦР в реальном времени выполняется в термоциклере, способном освещать каждый образец лучом света по крайней мере одной указанной длины волны и обнаруживать флуоресценцию, испускаемую возбужденным флуорофором . Термоциклер также может быстро нагревать и охлаждать образцы, тем самым используя физико-химические свойства нуклеиновых кислот и ДНК-полимеразы .

Процесс ПЦР обычно состоит из серии изменений температуры, которые повторяются 25–50 раз. Эти циклы обычно состоят из трех стадий: первая, при температуре около 95 ° C, позволяет разделить двойную цепь нуклеиновой кислоты; второй, при температуре около 50–60 ° C, позволяет связывать праймеры с матрицей ДНК; [7] третий, при температуре 68–72 ° C, способствует полимеризацииосуществляется ДНК-полимеразой. Из-за небольшого размера фрагментов последний этап обычно пропускается в этом типе ПЦР, поскольку фермент может увеличивать их количество во время перехода между этапом выравнивания и этапом денатурирования. Кроме того, в четырехэтапной ПЦР флуоресценция измеряется во время коротких температурных фаз, продолжающихся всего несколько секунд в каждом цикле, при температуре, например, 80 ° C, чтобы уменьшить сигнал, вызванный присутствием димеров праймеров. когда используется неспецифический краситель. [8] Температура и время, используемые для каждого цикла, зависят от множества параметров, таких как: фермент, используемый для синтеза ДНК, концентрация двухвалентных ионов и дезоксирибонуклеотидов.(dNTP) в реакции и температуре связывания праймеров. [9]

Химическая классификация [ править ]

Методики ПЦР в реальном времени можно классифицировать по химическому составу, используемому для обнаружения продукта ПЦР, специфических или неспецифических флуорохромов.

Неспецифическое обнаружение: ПЦР в реальном времени с использованием двухцепочечных ДНК-связывающих красителей в качестве репортеров [ править ]

ДНК-связывающий краситель связывается со всей двухцепочечной (ds) ДНК в ПЦР, увеличивая квантовый выход флуоресценции красителя. Поэтому увеличение количества продукта ДНК во время ПЦР приводит к увеличению интенсивности флуоресценции, измеряемой в каждом цикле. Однако красители дцДНК, такие как SYBR Green, будут связываться со всеми продуктами ПЦР дцДНК, включая неспецифические продукты ПЦР (такие как димер праймера ). Это потенциально может помешать или помешать точному мониторингу намеченной целевой последовательности.

В ПЦР в реальном времени с красителями дцДНК реакция готовится как обычно, с добавлением флуоресцентного красителя дцДНК. Затем реакцию запускают в приборе для ПЦР в реальном времени , и после каждого цикла интенсивность флуоресценции измеряется детектором; краситель флуоресцирует только при связывании с дцДНК (т.е. с продуктом ПЦР). Преимущество этого метода состоит в том, что для проведения амплификации требуется только пара праймеров, что снижает затраты; несколько последовательностей-мишеней можно контролировать в пробирке с использованием различных типов красителей.

Специфическое обнаружение: метод флуоресцентного репортерного зонда [ править ]

(1) В интактных пробах флуоресценция репортера подавлена. (2) Зонды и комплементарная цепь ДНК гибридизуются, и флуоресценция репортера все еще гасится. (3) Во время ПЦР зонд разрушается полимеразой Taq и высвобождается флуоресцентный репортер.

Флуоресцентные репортерные зонды обнаруживают только ДНК, содержащую последовательность, комплементарную зонду; поэтому использование репортерного зонда значительно увеличивает специфичность и позволяет выполнять методику даже в присутствии другой дцДНК. Используя разноцветные метки, флуоресцентные зонды можно использовать в мультиплексных анализах для мониторинга нескольких целевых последовательностей в одной пробирке. Специфичность флуоресцентных репортерных зондов также предотвращает вмешательство в измерения, вызванное димерами праймеров , которые являются нежелательными потенциальными побочными продуктами в ПЦР. Однако флуоресцентные репортерные зонды не предотвращают ингибирующий эффект димеров праймеров, который может подавлять накопление желаемых продуктов в реакции.

В этом методе используется зонд на основе ДНК с флуоресцентным репортером на одном конце и гасителем флуоресценции на противоположном конце зонда. Непосредственная близость репортера к тушителю предотвращает обнаружение его флуоресценции; разрушение зонда с помощью экзонуклеазной активности 5 '- 3' Taq-полимеразы нарушает близость репортер-тушитель и, таким образом, позволяет непогашенное излучение флуоресценции, которое может быть обнаружено после возбуждения лазером. Таким образом, увеличение количества продукта, на которое нацеливается репортерный зонд, в каждом цикле ПЦР вызывает пропорциональное увеличение флуоресценции из-за разрушения зонда и высвобождения репортера.

  1. ПЦР готовится как обычно (см. ПЦР ), и добавляется репортерный зонд.
  2. Когда реакция начинается, во время стадии отжига ПЦР и зонд, и праймеры отжигаются с ДНК-мишенью.
  3. Полимеризация новой цепи ДНК инициируется праймерами, и как только полимераза достигает зонда, ее 5'-3'-экзонуклеаза разрушает зонд, физически отделяя флуоресцентный репортер от гасителя, что приводит к увеличению флуоресценции.
  4. Флуоресценцию обнаруживают и измеряют в аппарате для ПЦР в реальном времени, и ее геометрическое увеличение, соответствующее экспоненциальному увеличению продукта, используют для определения цикла количественного определения (C q ) в каждой реакции.

Анализ температуры плавления [ править ]

Четкие кривые слияния для ряда продуктов ПЦР (показаны отчетливые цвета). Можно увидеть реакции амплификации для определенного продукта (розовый, синий) и других с отрицательным результатом (зеленый, оранжевый). Пик слияния, обозначенный стрелкой, показывает пик, вызванный димерами праймеров, который отличается от ожидаемого продукта амплификации. [10]

ПЦР в реальное время позволяет идентифицировать конкретный, амплифицированную ДНК - фрагменты с помощью анализа их температуры плавления (также называемой Т м значения, из м Элтинг т емпера тура ). Используемый метод обычно представляет собой ПЦР с двухцепочечными ДНК-связывающими красителями в качестве репортеров, а используемый краситель - обычно SYBR Green. Температура плавления ДНК специфична для амплифицированного фрагмента. Результаты этого метода получены путем сравнения кривых диссоциации проанализированных образцов ДНК. [11]

В отличие от обычной ПЦР, этот метод позволяет избежать предыдущего использования методов электрофореза для демонстрации результатов всех образцов. Это потому, что, несмотря на то, что это кинетический метод, количественная ПЦР обычно оценивается в определенной конечной точке. Поэтому метод обычно обеспечивает более быстрые результаты и / или использует меньше реагентов, чем электрофорез. Если требуется последующий электрофорез, необходимо протестировать только те образцы, которые оказались сомнительными при ПЦР в реальном времени, и / или утвердить результаты для образцов, которые дали положительный результат на определенный детерминант.

Моделирование [ править ]

В отличие от ПЦР по конечной точке (обычной ПЦР), ПЦР в реальном времени позволяет контролировать желаемый продукт в любой момент процесса амплификации путем измерения флуоресценции (в реальном масштабе времени измеряется ее уровень выше заданного порога). Обычно используемый метод количественной оценки ДНК с помощью ПЦР в реальном времени основан на построении графика зависимости флуоресценции от количества циклов в логарифмической шкале . Порог обнаружения флуоресценции на основе ДНК устанавливается в 3–5 раз больше стандартного отклонения шума сигнала над фоном. Количество циклов, при которых флуоресценция превышает пороговое значение, называется пороговым циклом (C t ) или, в соответствии с рекомендациями MIQE, циклом количественного определения (C q ) . [12]

Во время фазы экспоненциальной амплификации количество целевой ДНК-матрицы (ампликона) удваивается каждый цикл. Например, образец ДНК, C q которого опережает C q другого образца на 3 цикла, содержал в 2 3 = 8 раз больше матрицы. Однако эффективность амплификации часто варьируется среди праймеров и матриц. Следовательно, эффективность комбинации праймер-матрица оценивается в эксперименте по титрованию с последовательными разведениями ДНК-матрицы для создания стандартной кривой изменения (C q ) при каждом разведении. Наклон в линейной регрессиизатем используется для определения эффективности амплификации, которая составляет 100%, если разведение 1: 2 приводит к разнице (C q ), равной 1. Метод порогового цикла делает несколько предположений о механизме реакции и полагается на данные из низкого области отношения сигнал-шум профиля усиления, которые могут вносить существенные различия во время анализа данных. [13]

Для количественной оценки экспрессии гена (C q ) для РНК или ДНК из интересующего гена вычитается из (C q ) РНК / ДНК из гена домашнего хозяйства в том же образце, чтобы нормализовать вариации в количестве и качестве РНК между разными образцами. Эта процедура нормализации обычно называется ΔC t -методом [14].и позволяет сравнивать экспрессию интересующего гена среди различных образцов. Однако для такого сравнения экспрессия нормализующего эталонного гена должна быть очень похожей во всех образцах. Поэтому выбор эталонного гена, удовлетворяющего этому критерию, очень важен и часто является сложной задачей, потому что лишь очень немногие гены демонстрируют одинаковые уровни экспрессии в различных условиях или тканях. [15] [16] Хотя анализ пороговых значений цикла интегрирован со многими коммерческими программными системами, существуют более точные и надежные методы анализа данных профиля амплификации, которые следует учитывать в тех случаях, когда воспроизводимость является проблемой. [13]

Также были предложены методы количественной оценки количественной ПЦР на основе механизмов, и их преимущество состоит в том, что они не требуют стандартной кривой для количественной оценки. Было показано, что такие методы, как MAK2 [17], имеют такие же или лучшие количественные характеристики по сравнению с методами стандартной кривой. Эти основанные на механизмах методы используют знания о процессе амплификации полимеразы для получения оценок исходной концентрации образца. Расширение этого подхода включает точную модель всего профиля реакции ПЦР, которая позволяет использовать данные с высоким соотношением сигнал / шум и возможность проверки качества данных перед анализом. [13]

Согласно исследованию Ruijter et al. [18] MAK2 предполагает постоянную эффективность амплификации во время реакции ПЦР. Однако теоретический анализ полимеразной цепной реакции, из которой был получен MAK2, показал, что эффективность амплификации не является постоянной во время ПЦР. В то время как количественная оценка MAK2 обеспечивает надежные оценки концентрации целевой ДНК в образце при нормальных условиях кПЦР, MAK2 не дает надежной количественной оценки целевой концентрации для анализов количественной ПЦР с помощью конкурентов.

Приложения [ править ]

Существует множество приложений для количественной полимеразной цепной реакции в лаборатории . Он обычно используется как для диагностических, так и для фундаментальных исследований . Применение этого метода в промышленности включает количественную оценку микробной нагрузки в пищевых продуктах или растительных веществах, обнаружение ГМО ( генетически модифицированных организмов ), а также количественную оценку и генотипирование вирусных патогенов человека.

Количественная оценка экспрессии генов [ править ]

Количественная оценка экспрессии генов с помощью традиционных методов обнаружения ДНК ненадежна. Обнаружение мРНК с помощью Нозерн-блоттинга или продуктов ПЦР на геле или Саузерн-блоттинга не позволяет проводить точную количественную оценку. [19] Например, в течение 20–40 циклов типичной ПЦР количество продукта ДНК достигает плато , которое напрямую не коррелирует с количеством целевой ДНК в начальной ПЦР. [20]

ПЦР в реальном времени может использоваться для количественного определения нуклеиновых кислот двумя распространенными методами: относительное количественное определение и абсолютное количественное определение. [21] Абсолютное количественное определение дает точное количество молекул-мишеней ДНК путем сравнения со стандартами ДНК с использованием калибровочной кривой . Поэтому важно, чтобы ПЦР образца и стандарта имели одинаковую эффективность амплификации . [22] Относительная количественная оценка основана на внутренних контрольных генах для определения кратных различий в экспрессии целевого гена. Количественная оценка выражается как изменение уровней экспрессии мРНК, интерпретируемой как комплементарная ДНК (кДНК, полученная путем обратной транскрипции).мРНК). Относительную количественную оценку проводить легче, поскольку она не требует калибровочной кривой, поскольку количество исследуемого гена сравнивается с количеством контрольного эталонного гена.

Поскольку единицы, используемые для выражения результатов относительной количественной оценки, не важны, результаты можно сравнивать по ряду различных RTqPCR. Причина использования одного или нескольких генов домашнего хозяйства состоит в том, чтобы исправить неспецифические вариации, такие как различия в количестве и качестве используемой РНК, которые могут повлиять на эффективность обратной транскрипции и, следовательно, на эффективность всего процесса ПЦР. Однако наиболее важным аспектом процесса является то, что эталонный ген должен быть стабильным. [23]

Отбор этих эталонных генов традиционно осуществлялся в молекулярной биологии с использованием качественных или полуколичественных исследований, таких как визуальный анализ гелей РНК, денситометрия Нозерн- блоттинга или полуколичественная ПЦР (имитация ПЦР). Сейчас, в эпоху генома , можно провести более детальную оценку многих организмов с помощью транскриптомных технологий . [24] Однако исследования показали, что амплификация большинства эталонных генов, используемых для количественной оценки экспрессии мРНК, варьируется в зависимости от экспериментальных условий. [25] [26] [27] Следовательно, необходимо провести первичный статистический анализ. тщательное методологическое исследование с целью выбора наиболее подходящего референсного гена.

Был разработан ряд статистических алгоритмов, которые могут определять, какой ген или гены наиболее подходят для использования в данных условиях. Такие, как geNORM или BestKeeper, могут сравнивать пары или геометрические средние для матрицы различных эталонных генов и тканей . [28] [29]

Диагностическое использование [ править ]

Качественная диагностическая ПЦР применяется для быстрого обнаружения нуклеиновых кислот, которые используются для диагностики, например, инфекционных заболеваний , рака и генетических аномалий. Введение качественных ПЦР - анализов в клинической лаборатории микробиологии значительно улучшило диагностику инфекционных заболеваний, [30] и развернут в качестве инструмента для выявления новых возникающих заболеваний, таких как новых штаммов гриппа и коронавируса , [31] в диагностических тестах . [32] [33]

Микробиологическое использование [ править ]

Количественная ПЦР также используется микробиологами, работающими в области безопасности пищевых продуктов, их порчи и ферментации, а также для оценки микробного риска качества воды (питьевая и рекреационная вода), а также в сфере охраны здоровья населения. [34]

qPCR может также использоваться для амплификации таксономических или функциональных маркеров генов в ДНК, взятых из образцов окружающей среды. [35] Маркеры представлены генетическими фрагментами ДНК или комплементарной ДНК. [35] Путем амплификации определенного мягкого элемента можно количественно определить количество элемента в образце до амплификации. [35] Использование таксономических маркеров (рибосомных генов) и количественной ПЦР может помочь определить количество микроорганизмов в образце и идентифицировать различные семейства, роды или виды на основе специфичности маркера. [35] Использование функциональных маркеров (генов, кодирующих белок) может показать экспрессию генов в сообществе, что может раскрыть информацию об окружающей среде. [35]

Обнаружение фитопатогенов [ править ]

Сельскохозяйственная промышленность постоянно стремится производить отростки или саженцы растений, свободные от патогенных микроорганизмов, чтобы предотвратить экономические потери и сохранить здоровье. Были разработаны системы, позволяющие обнаруживать небольшие количества ДНК Phytophthora ramorum , оомицета, убивающего дубы и другие виды, смешанные с ДНК растения-хозяина. Различение ДНК патогена и растения основано на амплификации ITS-последовательностей, спейсеров, расположенных в кодирующей области гена рибосомной РНК , характерных для каждого таксона. [36] Полевые версии этого метода также были разработаны для идентификации того же патогена. [37]

Обнаружение генетически модифицированных организмов [ править ]

qPCR с использованием обратной транскрипции (RT-qPCR) может использоваться для обнаружения ГМО, учитывая его чувствительность и динамический диапазон при обнаружении ДНК. Альтернативы, такие как анализ ДНК или белка, обычно менее чувствительны. Используются специфические праймеры, которые амплифицируют не трансген, а промотор , терминатор или даже промежуточные последовательности, используемые в процессе конструирования вектора. Поскольку процесс создания трансгенного растения обычно приводит к вставке более чем одной копии трансгена, его количество также обычно оценивается. Это часто выполняется путем относительной количественной оценки с использованием контрольного гена из обработанных видов, который присутствует только в виде единственной копии. [38] [39]

Клиническая количественная оценка и генотипирование [ править ]

Вирусы могут присутствовать у людей из-за прямого заражения или сопутствующих инфекций, что затрудняет диагностику с использованием классических методов и может привести к неверному прогнозу и лечению. Использование кПЦР позволяет и количественной оценки и генотипирование (характеристика штамма, проводили с использованием кривых плавления) вируса , таких как вирус гепатита . [40] Степень инфицирования, определяемая количественно как количество копий вирусного генома на единицу ткани пациента, во многих случаях имеет значение; например, вероятность того, что вирус простого герпеса 1 типа реактивируется, связана с количеством инфицированных нейронов в ганглиях . [41]Эта количественная оценка выполняется либо с обратной транскрипцией, либо без нее, как это происходит, если вирус интегрируется в геном человека в любой момент своего цикла, как, например, в случае ВПЧ (вируса папилломы человека), где некоторые из его вариантов связано с появлением рака шейки матки . [42]

Ссылки [ править ]

  1. ^ Bustin С.А., Бенеш В, Гарсон JA, Hellemans Дж, Huggett Дж, Kubista М, Р Мюллера, Нолан Т, Pfaffl МВт, Шипли Г.Л., Vandesompele Дж, Виттвер КТ (2009). «Рекомендации MIQE: минимум информации для публикации количественных экспериментов ПЦР в реальном времени» . Клиническая химия . 55 (4): 611–622. DOI : 10,1373 / clinchem.2008.112797 . PMID  19246619 .
  2. ^ Логан, Джули; Эдвардс, Кирстин и Сондерс, Ник, ред. (2009). ПЦР в реальном времени: современные технологии и приложения . Caister Academic Press. ISBN 978-1-904455-39-4.
  3. ^ Уотсон, JD; Бейкер, TA; Белл, ИП; Ганн, А; Левин, М; Лосик, Р. (2004). Молекулярная биология гена (Пятое изд.). Сан-Франциско: Бенджамин Каммингс. ISBN 978-0-321-22368-5.
  4. ^ a b Майкл В. Пфафф, Алес Тихопад, Кристиан Пргомет и Таня П. Невианс (2005). Определение стабильных генов домашнего хозяйства, дифференциально регулируемых генов-мишеней и целостности образцов: BestKeeper - инструмент на основе Excel с использованием парных корреляций Biotechnology Letters 26 : 509–515
  5. ^ Пфаффл, МВт; Хорган, GW; Демпфл, Л. (2002). «Программный инструмент относительной экспрессии (REST ©) для группового сравнения и статистического анализа результатов относительной экспрессии в ПЦР в реальном времени» . Nucleic Acids Res . 30 (9): e36. DOI : 10.1093 / NAR / 30.9.e36 . PMC 113859 . PMID 11972351 .  
  6. ^ Вандесомпеле, Дж; Де Претер, К; Паттин, Ф; Поппе, Б; Ван Рой, N; Де Паэпе, А; Спелеман, Ф (2002). «Точная нормализация количественных данных ОТ-ПЦР в реальном времени путем геометрического усреднения множества генов внутреннего контроля» . Геномная биология . 3 (7): 1–12. DOI : 10.1186 / GB-2002-3-7-research0034 . PMC 126239 . PMID 12184808 .  
  7. ^ Rychlik Вт, Спенсер WJ, Роадс RE (1990). «Оптимизация температуры отжига для амплификации ДНК in vitro » . Nucleic Acids Res . 18 (21): 6409–6412. DOI : 10.1093 / NAR / 18.21.6409 . PMC 332522 . PMID 2243783 .  
  8. ^ Пфаффл, Майкл (2000). «Разработка и проверка внешне стандартизированной количественной ОТ-ПЦР инсулиноподобного фактора роста-1 с использованием технологии LightCycler SYBR Green I» (PDF) . Biochemica (3) - через gene-quantification.org.
  9. ^ Джозеф Сэмбрук и Дэвид В. Рассел (2001). Молекулярное клонирование: лабораторное руководство (3-е изд.). Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк: Лаборатория Колд-Спринг-Харбор. ISBN 978-0-87969-576-7.
  10. ^ Пончел Ф; Toomes C; Брансфилд К; Leong FT; Дуглас SH; Field SL; Bell SM; Combaret V; Puisieux A; Мигелл AJ (2003). «ПЦР в реальном времени на основе флуоресценции SYBR-Green I: альтернатива тесту TaqMan для относительной количественной оценки перестроек генов, амплификаций генов и делеций микрогенов» . BMC Biotechnol . 3 : 18. DOI : 10,1186 / 1472-6750-3-18 . PMC 270040 . PMID 14552656 .  
  11. ^ Рири КМ; Расмуссен Р.П .; Виттвер CT (1997). «Дифференциация продуктов с помощью анализа кривых плавления ДНК во время полимеразной цепной реакции» (PDF) . Аналитическая биохимия . 245 (2): 154–160. DOI : 10.1006 / abio.1996.9916 . PMID 9056205 .  
  12. ^ Стивен А. Бастин; Владимир Бенеш; Джереми А. Гарсон; Ян Хеллеманс; Джим Хаггетт; Микаэль Кубиста; Рейнхольд Мюллер; Таня Нолан; Майкл В. Пфаффл; Грегори Л. Шипли; Джо Вандесомпеле и Карл Т. Виттвер (апрель 2009 г.). «Рекомендации MIQE: минимум информации для публикации количественных экспериментов ПЦР в реальном времени» . Clin. Chem . 55 (4): 611–622. DOI : 10,1373 / clinchem.2008.112797 . PMID 19246619 . 
  13. ^ а б в Карр, AC; Мур, SD (2012). Люсия, Алехандро (ред.). «Надежная количественная оценка полимеразных цепных реакций с помощью глобального подбора» . PLOS ONE . 7 (5): e37640. Bibcode : 2012PLoSO ... 737640C . DOI : 10.1371 / journal.pone.0037640 . PMC 3365123 . PMID 22701526 .  
  14. ^ Schefe JH, Леман К.Е., Бушманн ИК, Унгер Т, Функа-Кайзер Н (2006). «Количественный анализ данных ОТ-ПЦР в реальном времени: современные концепции и новая формула« различия CT экспрессии генов »». J Mol Med . 84 (11): 901–910. DOI : 10.1007 / s00109-006-0097-6 . PMID 16972087 . 
  15. ^ Наилис Х, Коэне Т, Ван Ньивербург Ф, Дефорс D, Нелис ХД (2006). «Разработка и оценка различных стратегий нормализации для исследований экспрессии генов в биопленках Candida albicans с помощью ПЦР в реальном времени» . BMC Mol. Биол . 7 (1): 25. DOI : 10,1186 / 1471-2199-7-25 . PMC 1557526 . PMID 16889665 .  
  16. Перейти ↑ Nolan T, Hands RE, Bustin SA (2006). «Количественная оценка мРНК с использованием ОТ-ПЦР в реальном времени». Nat. Protoc . 1 (3): 1559–1582. DOI : 10.1038 / nprot.2006.236 . PMID 17406449 . 
  17. ^ Boggy G, Woolf PJ (2010). Раваси Т. (ред.). «Механистическая модель ПЦР для точной количественной оценки количественных данных ПЦР» . PLOS ONE . 5 (8): e12355. Bibcode : 2010PLoSO ... 512355B . DOI : 10.1371 / journal.pone.0012355 . PMC 2930010 . PMID 20814578 .  
  18. ^ Рёйтер JM, Pfaffl МВт, Чжао S, Шписсы А.Н., Boggy G, J Блого, Ратледдж Р.Г., Sisti D, Lievens А, Де Preter К, Derveaux S, Hellemans J, Vandesompele J (2012). «Оценка методов анализа кривой qPCR для надежного обнаружения биомаркеров: систематическая ошибка, разрешение, точность и последствия». Методы . 59 (1): 32–46. DOI : 10.1016 / j.ymeth.2012.08.011 . PMID 22975077 . 
  19. ^ Брюс Гелертер. «PEMF для лечения заболеваний роговицы» . lemuriatechnologies.com . Архивировано из оригинала на 2014-06-09.
  20. ^ Overbergh, L .; Giulietti, A .; Valckx, D .; Decallonne, R .; Bouillon, R .; Матье, К. (2003). «Использование ПЦР с обратной транскриптазой в реальном времени для количественной оценки экспрессии генов цитокинов» . Журнал биомолекулярных методов: JBT . 14 (1): 33–43. PMC 2279895 . PMID 12901609 .  
  21. ^ С. Дханасекаран; Т. Марк Доэрти; Джон Кеннет; Группа изучения испытаний ТБ (март 2010 г.). «Сравнение различных стандартов для абсолютного количественного определения на основе ПЦР в реальном времени». Журнал иммунологических методов . 354 (1–2): 34–39. DOI : 10.1016 / j.jim.2010.01.004 . PMID 20109462 . 
  22. ↑ Bar, Tzachi; Кубиста, Микаэль; Тихопад, Алесь (19.10.2011). «Подтверждение кинетического сходства в КПЦР» . Исследования нуклеиновых кислот . 40 (4): 1395–1406. DOI : 10.1093 / NAR / gkr778 . ISSN 0305-1048 . PMC 3287174 . PMID 22013160 .   
  23. ^ Бруннер, AM; Яковлев ИА; Штраус, SH (2004). «Валидация внутреннего контроля для количественных исследований экспрессии генов растений» . BMC Plant Biol . 4 : 14. DOI : 10,1186 / 1471-2229-4-14 . PMC 515301 . PMID 15317655 . Архивировано из оригинала на 2013-08-02.  
  24. ^ МакГеттиган, Пол А (2013). «Транскриптомика в эпоху RNA-seq». Текущее мнение в химической биологии . 17 (1): 4–11. DOI : 10.1016 / j.cbpa.2012.12.008 . PMID 23290152 . 
  25. ^ Thellin, О; Зорзи, В; Lakaye, B; Де Борман, B; Coumans, B; Henne, G; Grisar, T; Игут, А; Хайнен, Э (1999). «Гены домашнего хозяйства как внутренние стандарты: использование и ограничения» . J Biotechnol . 75 (2–3): 197–200. DOI : 10.1016 / s0168-1656 (99) 00163-7 . PMID 10617337 . 
  26. ^ Радоник, А; Thulke, S; Маккей, И. М.; Ландт, О; Зигерт, Вт; Ниче, А (2004). «Руководство по выбору эталонных генов для количественной ПЦР в реальном времени» . Biochem Biophys Res Commun . 313 (4): 856–862. DOI : 10.1016 / j.bbrc.2003.11.177 . PMID 14706621 . Архивировано из оригинала на 2013-08-02. 
  27. ^ Dheda, K; Huggett, JF; Бустин, С.А.; Джонсон, Массачусетс; Ладья, G; Зумла, А (2004). «Валидация генов домашнего хозяйства для нормализации экспрессии РНК в ПЦР в реальном времени» . Биотехнологии . 37 (1): 112–119. DOI : 10.2144 / 04371RR03 . PMID 15283208 . 
  28. ^ Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F, Poppe B, Van Roy N, De Paepe A, Speleman F (2002) Точная нормализация количественных данных ОТ-ПЦР в реальном времени путем геометрического усреднения нескольких генов внутреннего контроля " Genome Biol 37 : RESEARCH0034
  29. ^ Пфаффл, МВт; Тихопад, А; Prgomet, C; Невианс, TP (2004). «Определение стабильных генов домашнего хозяйства, дифференциально регулируемых генов-мишеней и целостности образца: BestKeeper - инструмент на основе Excel с использованием парных корреляций» . Biotechnol Lett . 26 (6): 509–515. DOI : 10.1023 / б: bile.0000019559.84305.47 . PMID 15127793 . Архивировано из оригинала на 2013-08-02. 
  30. ^ Espy, MJ (январь 2006). «ПЦР в реальном времени в клинической микробиологии: приложения для рутинных лабораторных исследований» . Обзоры клинической микробиологии . 19 (3): 165–256. DOI : 10.1128 / CMR.19.1.165-256.2006 . PMC 1360278 . PMID 16418529 .  
  31. ^ Дхамад, AE; Абдал Рида, Массачусетс (2020). «COVID-19: молекулярные и серологические методы обнаружения» . PeerJ . 8 : e10180. DOI : 10,7717 / peerj.10180 . PMID 33083156 . 
  32. ^ «FDA-одобренные анализы ОТ-ПЦР и другие молекулярные анализы на вирусы гриппа» (PDF) . cdc.gov .
  33. ^ «rRT-PCR, метод подтверждения случая коронавируса в Ухане - искусственный интеллект для химии» . Проверено 26 января 2020 .
  34. ^ Филион, М., изд. (2012). Количественная ПЦР в реальном времени в прикладной микробиологии . Caister Academic Press . ISBN 978-1-908230-01-0.
  35. ^ a b c d e Буше, Блиё, Декьед, Домэзон, Дюфрен, Феррейра, Годон, Хеллаль, Джулиан, Квайзер, Мартин-Лоран, Мофре, Монье, Пейре, Шмитт-Коплин, Сибур, Д'уарон, Биспо, Депорт Гранд, Куни, Марон, Ранджард (сентябрь 2016 г.). «Методы молекулярной микробиологии для диагностики окружающей среды» . Письма по химии окружающей среды . 14 (4): 423–441. DOI : 10.1007 / s10311-016-0581-3 . Дата обращения 11 мая 2020 .CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  36. Перейти ↑ Baldwin, BG (1992). «Филогенетическая полезность внутренних транскрибированных спейсеров ядерной рибосомальной ДНК в растениях: пример из Compositaogy». Молекулярная филогенетика и эволюция . 1 (1): 3–16. DOI : 10.1016 / 1055-7903 (92) 90030-K . PMID 1342921 . 
  37. ^ Tomlinson, JA; Barker, I .; Бунхэм, Н. (2007). «Более быстрые, простые, более специфические методы для улучшенного молекулярного обнаружения Phytophthora ramorum в полевых условиях» . Прикладная и экологическая микробиология . 73 (12): 4040–4047. DOI : 10,1128 / AEM.00161-07 . PMC 1932743 . PMID 17449689 .  
  38. ^ Хольст-Йенсен, Арне; Rønning, Sissel B .; Лёвсет, Астрид; Бердал, Кнут Г. (2003). «Технология ПЦР для скрининга и количественной оценки генетически модифицированных организмов (ГМО)». Аналитическая и биоаналитическая химия . 375 (8): 985–993. DOI : 10.1007 / s00216-003-1767-7 . PMID 12733008 . 
  39. ^ Brodmann PD; Ilg EC; Berthoud H; Херрманн А. (2002). "… Методы количественной полимеразной цепной реакции для четырех генетически модифицированных сортов кукурузы…" . Журнал AOAC International . 85 (3): 646–653. DOI : 10.1093 / jaoac / 85.3.646 . PMID 12083257 . 
  40. ↑ Yeh SH Tsai CY Kao JH Лю CJ Kuo TJ Lin MW Huang WL Lu SF Jih J. Chen DS Others (2004). «Количественная оценка и генотипирование вируса гепатита В в одной реакции с помощью ПЦР в реальном времени и плавления…». Журнал гепатологии . 41 (4): 659–666. DOI : 10.1016 / j.jhep.2004.06.031 . PMID 15464248 . 
  41. ^ Sawtell NM (1998). «Вероятность реактивации in vivo вируса простого герпеса типа 1 увеличивается с увеличением числа латентно инфицированных нейронов в ганглиях» . Журнал вирусологии . 72 (8): 6888–6892. DOI : 10,1128 / JVI.72.8.6888-6892.1998 . PMC 109900 . PMID 9658140 .  
  42. ^ Peter M. Rosty C. Кутюрье J. F. Ж. Радвани Тешима H. Састр-Гарау X. (2006). «Активация MYC, связанная с интеграцией ДНК ВПЧ в локусе MYC в генитальных опухолях» . Онкоген . 25 (44): 5985–5993. DOI : 10.1038 / sj.onc.1209625 . PMID 16682952 . 

Библиография [ править ]

  • Элиз; Худ, Ален (2002). "La PCR en temps réel: Principes et Applications" (PDF) . Обзоры по биологии и биотехнологии . 2 (2): 2–11. Архивировано из оригинального (PDF) 12 июня 2009 года.
  • Бустин, С.А. (2000). «Абсолютное количественное определение мРНК с использованием анализов полимеразной цепной реакции обратной транскрипции в реальном времени» . J Mol Endocrinol . 25 (2): 169–193. DOI : 10,1677 / jme.0.0250169 . PMID  11013345 .
  • Higuchi, R .; Dollinger, G .; Уолш, П.С.; Гриффит Р. (1992). «Одновременная амплификация и обнаружение специфических последовательностей ДНК». Биотехнологии . 10 (4): 413–417. DOI : 10.1038 / nbt0492-413 . PMID  1368485 .
  • Голландия, премьер-министр; Abramson, RD; Watson, R .; Гельфанд Д.Х. (1991). «Обнаружение продукта специфической полимеразной цепной реакции с использованием экзонуклеазной активности 50-30 ДНК-полимеразы Thermus aquaticus» . Proc. Natl. Акад. Sci. США . 88 (16): 7276–7280. Bibcode : 1991PNAS ... 88.7276H . DOI : 10.1073 / pnas.88.16.7276 . JSTOR  2357665 . PMC  52277 . PMID  1871133 .
  • Кубиста, М; Андраде, JM; Bengtsson, M; Фороотан, А; Jonak, J; Линд, К; Синделка, Р; Sjoback, R; Sjogreen, B; Стромбом, L; Штальберг, А; Зорич, Н. (2006). «Полимеразная цепная реакция в реальном времени». Мол. Аспекты Мед . 27 (2–3): 95–125. DOI : 10.1016 / j.mam.2005.12.007 . PMID  16460794 .
  • Higuchi, R .; Fockler, C .; Dollinger, G .; Уотсон, Р. (1993). «Кинетическая ПЦР: мониторинг реакций амплификации ДНК в реальном времени». Биотехнология . 11 (9): 1026–1030. DOI : 10.1038 / nbt0993-1026 . PMID  7764001 .
  • Филион, М. (2012). Количественная ПЦР в реальном времени в прикладной микробиологии . Caister Academic Press. ISBN 978-1-908230-01-0.
  • Wawrik, B; Пол, JH; Табита, FR (2002). «Количественное определение мРНК rbcL (рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы / оксигеназы) с помощью ПЦР в реальном времени у диатомовых водорослей и пелагофитов» . Appl. Environ. Microbiol . 68 (8): 3771–3779. DOI : 10.1128 / aem.68.8.3771-3779.2002 . PMC  123995 . PMID  12147471 .
  • Логан Дж; Эдвардс К; Сондерс Н, ред. (2009). ПЦР в реальном времени: современные технологии и приложения . Caister Academic Press. ISBN 978-1-904455-39-4.