Мутагенез с насыщением сайта (SSM) , или просто насыщение сайта , представляет собой метод случайного мутагенеза , используемый в инженерии белка , в котором один кодон или набор кодонов заменяется всеми возможными аминокислотами в этом положении. [1] Существует множество вариантов метода насыщения сайтов, от насыщения парных сайтов (насыщение двух позиций в каждом мутанте в библиотеке) до насыщения сайтов сканирования (выполнение насыщения сайтов в каждом сайте в белке, что приводит к библиотеке размера [20 x (количество остатков в белке)], который содержит все возможные точечные мутанты белка).
Методика
Насыщенный мутагенез обычно достигается с помощью сайт-направленного мутагенеза ПЦР с рандомизированным кодоном в праймерах (например, SeSaM ) [2] или с помощью искусственного генного синтеза со смесью синтезируемых нуклеотидов, используемых в кодонах, которые должны быть рандомизированы. [3]
Для кодирования наборов аминокислот можно использовать различные вырожденные кодоны. [1] Поскольку некоторые аминокислоты кодируются большим количеством кодонов, чем другие, точное соотношение аминокислот не может быть равным. Кроме того, обычно используются вырожденные кодоны, которые минимизируют стоп-кодоны (что обычно нежелательно). Следовательно, полностью рандомизированный «NNN» не идеален, и используются альтернативные, более ограниченные вырожденные кодоны. «NNK» и «NNS» имеют то преимущество, что кодируют все 20 аминокислот, но все же кодируют стоп-кодон в 3% случаев. Альтернативные кодоны, такие как «NDT», «DBK», полностью избегают стоп-кодонов и кодируют минимальный набор аминокислот, который по-прежнему охватывает все основные биофизические типы (анионные, катионные, алифатические гидрофобные, ароматические гидрофобные, гидрофильные, небольшие). [1] Если нет ограничений на использование только одного вырожденного кодона, можно значительно уменьшить смещение. [4] [5] Несколько вычислительных инструментов были разработаны для обеспечения высокого уровня контроля над вырожденными кодонами и соответствующими им аминокислотами. [6] [7] [8]
Вырожденный кодон | Кол-во кодонов | Кол-во аминокислот | Кол-во остановок | Закодированные аминокислоты |
---|---|---|---|---|
NNN | 64 | 20 | 3 | Все 20 |
NNK / NNS | 32 | 20 | 1 | Все 20 |
Неразрушающий контроль | 12 | 12 | 0 | RNDCGHILFSYV |
БРК | 18 | 12 | 0 | ARCGILMFSTWV |
NRT | 8 | 8 | 0 | RNDCGHSY |
Приложения
Насыщенный мутагенез обычно используется для создания вариантов направленной эволюции . [9] [10]
Смотрите также
Рекомендации
- ^ а б в Ритц, MT; Carballeira JD (2007). «Итерационный мутагенез насыщения (ISM) для быстрой направленной эволюции функциональных ферментов». Протоколы природы . 2 (4): 891–903. DOI : 10.1038 / nprot.2007.72 . PMID 17446890 .
- ^ Чжэн, Лэй; Бауманн, Ульрих; Реймон, Жан-Луи (2004-07-15). «Эффективный одноэтапный сайт-направленный и сайт-насыщенный протокол мутагенеза» . Исследования нуклеиновых кислот . 32 (14): e115. DOI : 10.1093 / NAR / gnh110 . ISSN 0305-1048 . PMC 514394 . PMID 15304544 .
- ^ Reetz, Manfred T .; Прасад, Шринатх; Carballeira, José D .; Гумуля, Йозефин; Бокола, Марко (07.07.2010). «Итерационный мутагенез насыщения ускоряет лабораторную эволюцию стереоселективности ферментов: строгое сравнение с традиционными методами». Журнал Американского химического общества . 132 (26): 9144–9152. DOI : 10.1021 / ja1030479 . ISSN 0002-7863 . PMID 20536132 .
- ^ Килле, Сабрина; Acevedo-Rocha, Carlos G .; Parra, Loreto P .; Чжан, Чжи-Ган; Opperman, Diederik J .; Reetz, Manfred T .; Асеведо, Хуан Пабло (15 февраля 2013 г.). «Снижение избыточности кодонов и усилия по скринингу комбинаторных библиотек белков, созданных с помощью мутагенеза насыщения». Синтетическая биология ACS . 2 (2): 83–92. DOI : 10.1021 / sb300037w . PMID 23656371 .
- ^ Тан, Ликсия; Ван, Сюн; Ру, Бэйбэй; Сунь, Хэнфэй; Хуанг, Цзянь; Гао, Хуэй (июнь 2014 г.). «MDC-Analyzer: новый инструмент проектирования вырожденных праймеров для создания интеллектуальных библиотек мутагенеза с смежными сайтами» . Биотехнологии . 56 (6): 301–302, 304, 306–308, пасс. DOI : 10.2144 / 000114177 . ISSN 1940-9818 . PMID 24924390 .
- ^ Halweg-Edwards, Andrea L .; Сосны, Гур; Винклер, Джеймс Д .; Сосны, Ассаф; Гилл, Райан Т. (16 сентября 2016 г.). «Веб-интерфейс для сжатия кодонов». Синтетическая биология ACS . 5 (9): 1021–1023. DOI : 10.1021 / acssynbio.6b00026 . ISSN 2161-5063 . PMID 27169595 .
- ^ Энгквист, Мартин К.М.; Нильсен, Йенс (30 апреля 2015 г.). «ANT: Программное обеспечение для генерации и оценки вырожденных кодонов для естественных и расширенных генетических кодов». Синтетическая биология ACS . 4 (8): 935–938. DOI : 10.1021 / acssynbio.5b00018 . PMID 25901796 .
- ^ Келл, Дуглас Б.; День, Филип Дж .; Брейтлинг, Райнер; Грин, Люси; Каррин, Эндрю; Суэйнстон, Нил (10.07.2017). «CodonGenie: оптимизированные средства разработки неоднозначных кодонов» . PeerJ Computer Science . 3 : e120. DOI : 10.7717 / peerj-cs.120 . ISSN 2376-5992 .
- ^ Чика, Роберт А .; и другие. (2005). «Полурациональные подходы к инженерии активности ферментов: сочетание преимуществ направленной эволюции и рационального дизайна». Текущее мнение в области биотехнологии . 16 (4): 378–384. DOI : 10.1016 / j.copbio.2005.06.004 . PMID 15994074 .
- ^ Shivange, Amol V; Мариенхаген, Ян; Мундхада, Хеманшу; Шенк, Александр; Шванеберг, Ульрих (2009-02-01). «Достижения в создании функционального разнообразия для направленной эволюции белка». Текущее мнение в химической биологии . Биокатализ и биотрансформация / Биоинорганическая химия. 13 (1): 19–25. DOI : 10.1016 / j.cbpa.2009.01.019 . PMID 19261539 .