Мутагенез насыщения последовательности
Мутагенез с насыщением последовательностей ( SeSaM ) представляет собой химико-ферментативный метод случайного мутагенеза , применяемый для направленной эволюции белков и ферментов . [ Править ] Это один из наиболее распространенных методов мутагенеза насыщения . На четырех этапах реакции на основе ПЦР фосфоротиоатные нуклеотиды вставляются в последовательность гена , расщепляются, а полученные фрагменты удлиняются за счет универсальных или вырожденных нуклеотидов .. Эти нуклеотиды затем заменяются стандартными нуклеотидами, что обеспечивает широкое распространение мутаций нуклеиновых кислот, распространяющихся по последовательности генов, с предпочтением трансверсий и с уникальным акцентом на последовательных точечных мутациях, которые трудно получить с помощью других методов мутагенеза. Метод был разработан профессором Ульрихом Шванебергом из Бременского университета Якобса и Рейнско-Вестфальского технического университета Ахена .
SeSaM был разработан для преодоления нескольких основных ограничений, возникающих при работе со стандартными методами мутагенеза, основанными на простых методах ПЦР, подверженных ошибкам (epPCR). Эти методы epPCR основаны на использовании полимераз и, таким образом, сталкиваются с ограничениями, которые в основном возникают из-за того обстоятельства, что выполняются только одиночные, но очень редко последовательные замены нуклеиновых кислот, и что эти замены обычно происходят только в определенных предпочтительных положениях. Кроме того, трансверсии нуклеиновых кислот гораздо менее вероятны, чем переходы , и требуют специально разработанных полимераз с измененным смещением . [1]Эти характеристики катализируемых epPCR обменов нуклеиновыми кислотами вместе с тем фактом, что генетический код вырожден , уменьшают результирующее разнообразие на уровне аминокислот . Синонимические замены приводят к сохранению аминокислот, или широко распространены консервативные мутации со сходными физико-химическими свойствами, такими как размер и гидрофобность . [2] [3] Путем неспецифического введения универсальных оснований в каждое положение последовательности гена SeSaM преодолевает смещение полимеразы в пользу временных замен в определенных положениях, но открывает полную последовательность гена для разнообразного набора аминокислотных обменов. [4]
При разработке SeSaM-метода было введено несколько модификаций, позволяющих вводить несколько мутаций одновременно. [5] Еще одно усовершенствование метода было достигнуто за счет введения вырожденных оснований вместо универсального инозина и использования оптимизированных ДНК-полимераз, что еще больше увеличило долю введенных трансверсий. [6] Этот модифицированный метод SeSaM-TV+, кроме того, позволяет и способствует введению двух последовательных замен нуклеотидов, сильно расширяя спектр аминокислот, которые могут быть заменены.
С помощью нескольких оптимизаций, включая применение улучшенной химерной полимеразы на этапе III метода SeSaM-TV-II [7] [8] и добавление альтернативного вырожденного нуклеотида для эффективной замены тиминовых и цитозиновых оснований и увеличения частоты мутаций в SeSaM. -P/R, [9] сгенерированные библиотеки были дополнительно улучшены в отношении количества трансверсий, а количество последовательных мутаций было увеличено до 2–4 последовательных мутаций с частотой последовательных мутаций до 30%. [10]
Метод SeSaM состоит из четырех этапов, основанных на ПЦР, которые можно выполнить в течение двух-трех дней. Основные части включают включение фосфоротиоатных нуклеотидов, химическую фрагментацию в этих положениях, введение универсальных или вырожденных оснований и их замену природными нуклеотидами с точечными мутациями.
Первоначально с помощью ПЦР встраиваются универсальные «SeSaM»-последовательности с ген-специфическими праймерами, связывающимися перед интересующим геном и за ним. Интересующий ген с его фланкирующими областями амплифицируют для введения этих последовательностей SeSaM_fwd и SeSaM_rev и для создания матрицы для последовательных этапов ПЦР.
