Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

Анализ синтетического генетического массива ( SGA ) - это высокопроизводительный метод исследования синтетических смертельных и синтетических болезней генетических взаимодействий ( SSL ). [1] SGA позволяет систематически конструировать двойные мутанты, используя комбинацию рекомбинантных генетических методов , этапов скрещивания и отбора. Используя методологию SGA, мутант с делецией гена запроса может быть скрещен со всем набором делеций генома для идентификации любого SSL.взаимодействия, что дает функциональную информацию о гене запроса и генах, с которыми он взаимодействует. Крупномасштабное применение SGA, в котором ~ 130 генов запроса были скрещены с набором ~ 5000 жизнеспособных делеционных мутантов в дрожжах, выявило генетическую сеть, содержащую ~ 1000 генов и ~ 4000 взаимодействий SSL. [2] Результаты этого исследования показали, что гены со схожими функциями имеют тенденцию взаимодействовать друг с другом, а гены со схожими паттернами генетических взаимодействий часто кодируют продукты, которые, как правило, работают в одном и том же пути или в комплексе. Анализ синтетического генетического массива первоначально был разработан с использованием модельного организма S. cerevisiae . С тех пор этот метод был расширен, чтобы охватить 30% генома S. cerevisiae . [3]С тех пор была разработана методология, позволяющая проводить анализ SGA в S.pombe [4] [5] и E. coli . [6] [7]

Массив дрожжей показывает синтетические летальные взаимодействия. Синтетические летальные взаимодействия - это пары колоний со сниженным ростом или без него.

Фон [ править ]

Синтетический анализ генетического массива был первоначально разработан Тонгом и соавт. [1] в 2001 г. и с тех пор использовался многими группами, работающими в широком диапазоне биомедицинских областей. SGA использует весь набор нокаутов генома дрожжей, созданный проектом делеции генома дрожжей. [8]

Процедура [ править ]

Синтетический генетический анализ массивов обычно проводится с использованием массивов колоний на чашках Петри при стандартной плотности (96, 384, 768, 1536). Для выполнения анализа SGA в S.cerevisae делеция гена запроса систематически скрещивается с массивом делеционных мутантов (DMA), содержащим каждую жизнеспособную нокаутную ORF генома дрожжей (в настоящее время 4786 штаммов). [9] Полученные диплоиды затем спорулируют путем переноса в среду, содержащую восстановленный азот. Затем гаплоидное потомство подвергают серии селекционных посевов и инкубаций для отбора двойных мутантов. Двойные мутанты проверяют на SSL-взаимодействия визуально или с помощью программного обеспечения для визуализации, оценивая размер полученных колоний.

Репликация дрожжевых колоний во время анализа SGA с помощью пиннинг-робота

Робототехника [ править ]

Из-за большого количества точных шагов репликации в анализе SGA, роботы широко используются для выполнения манипуляций с колониями. Существует несколько систем, специально разработанных для анализа SGA, которые значительно сокращают время анализа запрашиваемого гена. Как правило, они имеют ряд штифтов, которые используются для переноса клеток на планшеты и из них, а в одной системе используются одноразовые подушечки штифтов для исключения циклов стирки. Компьютерные программы можно использовать для анализа размеров колоний по изображениям чашек, тем самым автоматизируя оценку SGA и химико-генетическое профилирование.

Шаг к созданию системы генетического скрининга с высоким содержанием генома дрожжей (дорожная карта SGA) [ править ]

Есть шесть основных компонентов

  1. Коллекция мутантов
  2. Материал и инструменты для работы с мутантами
  3. Система анализа изображений
  4. Автоматическая система количественной оценки и оценки
  5. Подтверждение подходов
  6. Инструменты анализа данных
  • Коллекция мутантов

Первым шагом является сбор мутантов и создание библиотеки мутантов в твердой или жидкой среде. Твердые носители могут быть лучше, потому что они могут сэкономить много времени. На ранней стадии создание мутанта было выполнено методом гомологичной рекомбинации. У нас есть отличная библиотека мутантов для Saccharomyces cerevisiae , хорошо изученного модельного организма.

Однако, если вы пытаетесь создать новую модель дрожжей, вам может потребоваться секвенирование генома и прогнозирование возможной ORF с помощью хорошего эталонного генома дрожжей (например, с Saccharomyces cerevisiae). Рассмотрим особый случай: если у вас нет эталонного генома, вам следует пройти анализ транскриптома и генома этого нового модельного организма.

  • Материалы и инструменты для работы с мутантами
    Когда у вас есть библиотека мутантов на твердом носителе. Если мутанты находятся в твердой среде, мы расположили мутанты в соотношении 1: 3, то есть от одного массива мутантов дикого типа до трех (почему? Дикий тип работает как внутренний контроль, а в твердой среде питательные вещества не должны распределяться поровну, чтобы избежать предвзятость). Когда у вас есть мутанты с удаленным одним геном, вы можете запускать инструменты для работы с мутантами. В SGA это называется «закрепление». Версии ROTOR-HAD (называемые роботами-закрепителями), используемые для закрепления мутантов дрожжей. На этой машине установлен удобный интерфейс, который помогает прикреплять образцы из исходных пластин к экспериментальным пластинам.
  1. Система анализа изображений
  2. Автоматическая система количественной оценки и оценки
  3. Подтверждение подходов
  4. Инструменты анализа данных

Коллекция мутантов [ править ]

См. Также [ править ]

Ссылки [ править ]

  1. ^ a b Тонг, AHY; Евангелиста, М .; Parsons, AB; Xu, H .; Bader, GD; Pagé, N .; Робинсон, М .; Raghibizadeh, S .; Hogue, CW; Bussey, H .; Эндрюс, B .; Tyers, M .; Бун, К. (2001). «Систематический генетический анализ с упорядоченными массивами мутантов делеции дрожжей». Наука . 294 (5550): 2364–2368. DOI : 10.1126 / science.1065810 . PMID  11743205 .
  2. ^ Тонг, AHY; Lesage, G .; Bader, GD; Ding, H .; Xu, H .; Xin, X .; Young, J .; Berriz, GF; Brost, RL; Chang, M .; Chen, Y .; Cheng, X .; Chua, G .; Friesen, H .; Goldberg, DS; Haynes, J .; Humphries, C .; Он, G .; Hussein, S .; Ke, L .; Krogan, N .; Ли, З .; Левинсон, JN; Lu, H .; Ménard, P .; Munyana, C .; Parsons, AB; Ryan, O .; Тоникян, Р .; Робертс, Т. (2004). «Глобальное картирование сети генетического взаимодействия дрожжей». Наука . 303 (5659): 808–813. DOI : 10.1126 / science.1091317 . PMID 14764870 . 
  3. ^ Костанцо, М .; Барышникова, А .; Bellay, J .; Kim, Y .; Копье, ЭД; Севье, CS; Ding, H .; Ко, JLY; Toufighi, K .; Мостафави, С .; Prinz, J .; Сент-Ондж, РП; Vandersluis, B .; Махневич, Т .; Vizeacoumar, FJ; Ализаде, С .; Bahr, S .; Brost, RL; Chen, Y .; Cokol, M .; Deshpande, R .; Ли, З .; Lin, Z. -Y .; Liang, W .; Марбак, М .; Paw, J .; Сан-Луис, Б. -Дж .; Shuteriqi, E .; Тонг, AHY; Ван Дайк, Н. (2010). «Генетический ландшафт клетки» . Наука . 327 (5964): 425–431. DOI : 10.1126 / science.1180823 . PMC 5600254 . PMID 20093466 .  
  4. ^ Рогуев, А .; Wiren, M .; Weissman, JS; Кроган, Нью-Джерси (2007). «Высокопроизводительное картирование генетического взаимодействия в делящихся дрожжах Schizosaccharomyces pombe». Природные методы . 4 (10): 861–866. DOI : 10.1038 / nmeth1098 . PMID 17893680 . 
  5. ^ Диксон, SJ; Федишин, Ю .; Ко, JLY; Прасад, ТСК; Chahwan, C .; Chua, G .; Toufighi, K .; Барышникова, А .; Hayles, J .; Hoe, K. -L .; Kim, D. -U .; Парк, Х. -О .; Майерс, CL; Pandey, A .; Durocher, D .; Эндрюс, Би Джей; Бун, К. (2008). «Значительное сохранение синтетических сетей летального генетического взаимодействия между отдаленно родственными эукариотами» . Труды Национальной академии наук . 105 (43): 16653–16658. DOI : 10.1073 / pnas.0806261105 . PMC 2575475 . PMID 18931302 .  
  6. ^ Typas, A .; Николс, Р.Дж.; Siegele, DA; Сланцы, М .; Коллинз, SR; Lim, B .; Braberg, H .; Yamamoto, N .; Takeuchi, R .; Ваннер, Б.Л .; Mori, H .; Weissman, JS; Кроган, штат Нью-Джерси; Гросс, Калифорния (2008). «Высокопроизводительный количественный анализ генетических взаимодействий E. Coli» . Природные методы . 5 (9): 781–787. DOI : 10.1038 / nmeth.1240 . PMC 2700713 . PMID 19160513 .  
  7. ^ Butland, G .; Бабу, М .; Díaz-Mejía, JJ; Богдана, Ф .; Phanse, S .; Золото, B .; Yang, W .; Li, J .; Гагаринова, АГ; Pogoutse, O .; Mori, H .; Ваннер, Б.Л .; Lo, H .; Васневски, Дж .; Christopolous, C .; Али, М .; Venn, P .; Safavi-Naini, A .; Кислый, N .; Caron, S .; Чой, JY; Laigle, L .; Назарян-Армавил, А .; Deshpande, A .; Joe, S .; Даценко К.А.; Yamamoto, N .; Эндрюс, Би Джей; Boone, C .; Дин, Х. (2008). «ESGA: анализ синтетического генетического массива E. Coli». Природные методы . 5 (9): 789–795. DOI : 10.1038 / nmeth.1239 . PMID 18677321 . 
  8. ^ " Проект удаления генома Saccharomyces " .
  9. ^ "Нокаутные штаммы дрожжей" . Откройте Биосистемы . Архивировано из оригинального 19 ноября 2011 года.