Определение конца транс-сплайсированной РНК, связанной с экзоном
Транссплайсированное определение концов РНК, сопряженных с экзонами (TEC-RED), представляет собой транскриптомный метод , который, как и SAGE , позволяет проводить цифровое обнаружение последовательностей информационной РНК. В отличие от SAGE, обнаружение и очистка транскриптов с 5'-конца матричной РНК требует наличия транс-сплайсированной лидерной последовательности.
Лидерные последовательности сплайсинга представляют собой короткие последовательности некодирующей РНК , не обнаруженные внутри самого гена, которые присоединены к 5'-концу всех или части мРНК, транскрибируемых в организме. Было обнаружено, что у нескольких видов они ответственны за разделение полицистронных транскриптов на мРНК одного гена , а у других — за сплайсинг моноцистронных транскриптов. [1] Основная роль транс-сплайсинга моноцистронных транскриптов в значительной степени неизвестна. [2] Было высказано предположение, что они могут действовать как независимый промотор, который способствует тканеспецифической экспрессии независимых изоформ белка. [3] Лидеры сплайсинга были обнаружены у трипаносоматид, эвглены , плоских червей,Ценоррабдит . [1] [4] Некоторые виды содержат только одну сплайсированную лидерную последовательность, обнаруженную на всех мРНК. У C. elegans видны два вида, обозначенные как SL1 и SL2 . [5]
Тотальную РНК очищают от интересующего образца. Затем РНК- мессенджер Poly A очищают от тотальной РНК и затем транслируют в кДНК с использованием реакции обратной транскрипции. кДНК , полученная из мРНК , метится с помощью праймеров, гомологичных сплайсированным лидерным последовательностям организма. В девятистадийной ПЦР кДНК встраиваются одновременно с сайтом эндонуклеазы рестрикции BpmI (хотя может работать любая эндонуклеаза рестрикции класса II) и биотиновой меткой, которые присутствуют в праймерах. Затем эти меченые кДНК расщепляются на 14 п.н. ниже сайта узнавания с использованием BpmI.эндонуклеазой рестрикции и тупыми концами ДНК-полимеразы Т4. Фрагменты дополнительно очищают от постороннего материала ДНК с помощью биотиновых меток, чтобы связать их со стрепдавидиновой матрицей. Затем их лигируют с адаптерной ДНК в шести отдельных реакциях, содержащих шесть разных сайтов узнавания эндонуклеазами рестрикции. Затем эти теги амплифицируют с помощью ПЦР с праймерами, содержащими несоответствие, заменяющее сайт Bpm1 на сайт Xho1. Ампликоны конкатенируют и лигируют в плазмидный вектор . Затем клональные векторы секвенируют и картируют в геноме. [6]
Объединение тегов, разработанное в 2004 году, отличается от того, что используется в SAGE. Расщепление меток с помощью Xho1 и смешение различных образцов с последующим лигированием образуют первый этап объединения. На втором этапе используется одна из эндонуклеаз рестрикции с консенсусом к адаптерной молекуле, присоединенной к 3'-концу. Их снова лигируют и проводят ПЦР для очистки образцов для следующего соединения. Конкатенация продолжается со второй эндонуклеазой рестрикции, затем с третьей и, наконец, с четвертой. Это приводит к конкатамеру, образованному шестью эндонуклеазными лигированиями, содержащими 32 метки, расположенными от 5' до 5' вокруг сайта Xho1. [6]В SAGE конкатенация происходит после формирования ditags и их амплификации с помощью ПЦР. Линкеры на внешней стороне диметок расщепляются ферментом, обеспечившим их связывание, и эти диметки с липкими концами случайным образом соединяются и помещаются в клонирующий вектор. [7]
