Из Википедии, бесплатной энциклопедии
  (Перенаправлено из экспериментов с тройным резонансом )
Перейти к навигации Перейти к поиску

Эксперименты с тройным резонансом представляют собой набор экспериментов по многомерной спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР), которые связывают три типа атомных ядер , чаще всего состоящие из 1 H, 15 N и 13 C. Эти эксперименты часто используются для определения конкретных резонансных сигналов для конкретные атомы в изотопно-обогащенном белке. Впервые этот метод был описан в работах Эда Бакса , Мицухико Икура и Льюиса Кея в 1990 г. [1] [2]а затем к набору экспериментов были добавлены дальнейшие эксперименты. Многие из этих экспериментов с тех пор стали стандартным набором экспериментов, используемых для последовательного определения резонансов ЯМР при определении структуры белка с помощью ЯМР . В настоящее время они являются неотъемлемой частью исследования белков методом ЯМР в растворе, а также могут использоваться в твердотельном ЯМР . [3] [4]

Фон [ править ]

Существует два основных метода определения структуры белка на атомном уровне. Первый из них - рентгеновская кристаллография , начиная с 1958 года, когда была определена кристаллическая структура миоглобина . Второй метод - это ЯМР, который начался в 1980-х годах, когда Курт Вютрих изложил основы для определения структуры белков с помощью ЯМР и решил структуру небольших глобулярных белков. [5] Ранний метод определения структуры белка с помощью ЯМР основывался на протонной гомоядерной ЯМР-спектроскопии, в которой размер белка, который может быть определен, ограничен ~ 10 кДа. Это ограничение связано с необходимостью присвоения сигналов ЯМР от большого количества ядер в белке - в большем белке большее количество ядер приводит к переполнению резонансов, а увеличение размера белка также расширяет сигналы, создавая резонанс. задание сложное. Эти проблемы могут быть решены с помощью гетероядерной ЯМР-спектроскопии, которая позволяет редактировать спектр протонов с учетом химических сдвигов 15 N и 13 C., а также уменьшает перекрытие резонансов за счет увеличения числа измерений спектра. В 1990 году Ад Бакс и его коллеги разработали технологию тройного резонанса и экспериментировали с белками, изотопно меченными 15 N и 13 C [1], в результате чего спектры значительно упрощаются, что значительно упрощает процесс определения резонанса и увеличивает размер белка, который можно определить с помощью ЯМР.

Эти эксперименты с тройным резонансом используют относительно большие магнитные связи между определенными парами ядер для установления их связи. В частности, связи 1 J NH , 1 J CH , 1 J CC и 1 J CN используются для установления пути скалярной связи между ядрами. Процесс переноса намагниченности происходит через несколько эффективных этапов переноса намагниченности с одной связью, а не за один этап через меньшие и переменные 3 J HHмуфты. Относительно большой размер и хорошая однородность соединений с одной связью позволили разработать эффективные схемы переноса намагниченности, которые эффективно однородны по данному белку, почти независимо от конформации. [3] Эксперименты с тройным резонансом с участием 31 P также могут быть использованы для исследований нуклеиновых кислот. [6]

Набор экспериментов [ править ]

Последовательное отнесение с использованием экспериментов тройного резонанса
Верхний и нижний рисунки показывают путь переноса намагниченности с выделенными атомами в виде пиков. На среднем рисунке показано, как появляются пики в спектрах, здесь они представлены как наложение полос спектров HNCACB и CBCA (CO) NH. Пики CBCA (CO) NH показаны на графике интенсивности и окрашены в желтый цвет; они идентифицируют резонансы предшествующих Cα и Cβ. HNCACB находится в контурной диаграмме и обычно показывает 4 пика для каждой полоски, по два от остатка и от предыдущего. Красные пики соответствуют Cα, а синие пики - Cβ. Здесь синие пики Cβ треонина и аланина различимы и легко идентифицируются, тогда как глицин, в котором отсутствует Cβ, дает только один пик. Однако другие типы остатков не так легко различить.

Эти эксперименты обычно называются ядрами (H, N и C), участвующими в эксперименте. CO относится к карбонильному углероду , тогда как CA и CB относятся к Cα и Cβ соответственно, аналогично HA и HB для Hα и Hβ (примеры экспериментов см. На диаграмме). Ядра в названии упорядочены в той же последовательности, что и в пути передачи намагниченности, ядра, помещенные в круглые скобки, участвуют в пути передачи намагниченности, но не регистрируются. Из соображений чувствительности эти эксперименты обычно начинаются на протоне и заканчиваются на протоне, как правило, с помощью INEPT.и обратные шаги INEPT. Следовательно, многие из этих экспериментов можно назвать экспериментами «туда и обратно», где, хотя это и не указано в названии, намагниченность передается обратно стартовому протону для получения сигнала.

Некоторые из экспериментов используются в тандеме для определения резонанса белка, например, HNCACB может использоваться вместе с CBCA (CO) NH в качестве пары экспериментов. Не все эти эксперименты необходимо записывать для последовательного назначения (это можно сделать всего с двумя), однако дополнительные пары экспериментов полезны для независимой оценки правильности назначения, а избыточность информации может потребоваться, когда в заданиях есть двусмысленность. Другие эксперименты также необходимы, чтобы полностью определить резонансы боковой цепи.

Существуют версии TROSY многих из этих экспериментов для улучшения чувствительности. [7] Эксперименты с тройным резонансом также могут быть использованы для определения резонанса основной цепи для конкретных последовательностей спектров ЯМР вращения под магическим углом в твердотельном ЯМР . [4] [8]

Было проведено большое количество экспериментов с тройным резонансом ЯМР, и эксперименты, перечисленные ниже, не являются исчерпывающими.

HNCO [ править ]

Эксперимент устанавливает связи между амидом остатка с карбонильным углеродом предыдущих остатков. [2] Это самый чувствительный из экспериментов с тройным резонансом. Боковые цепи карбоксамиды из аспарагина и глутамина также видны в этом эксперименте. Кроме того, гуанидина группа аргинина , который имеет аналогичную константу связи к группе карбоксамида, также может появиться в этом спектре. Этот эксперимент иногда используют вместе с HN (CA) CO.

HN (CA) CO [ править ]

Здесь амидный резонанс остатка коррелирует с карбонильным углеродом того же остатка, а также предыдущего остатка. Резонансы внутри остатков обычно сильнее, чем резонансы между остатками. [9]

HN (CO) CA [ править ]

Основная статья: эксперимент HNCOCA

Этот эксперимент коррелирует резонансы амида остатка с Cα предыдущего остатка. Этот эксперимент часто используют вместе с HNCA. [10]

HNCA [ править ]

Основная статья: эксперимент HNCA

Этот эксперимент коррелирует химический сдвиг амида остатка с Сα того же остатка, а также смещения предыдущего остатка. [2] Каждая полоска дает два пика, пики Cα между остатками и внутри остатков. Пик от предыдущего Cα может быть идентифицирован из эксперимента HN (CO) CA, который дает только Cα между остатками.

CBCA (CO) NH [ править ]

CBCA (CO) NH или, альтернативно, HN (CO) CACB, коррелирует резонансы амида остатка с Cα и Cβ предыдущего остатка. [11] Таким образом, для каждого остатка видны два пика, соответствующие Cα и Cβ. Этот эксперимент обычно используется вместе с HNCACB. Карбоксамид боковой цепи глутаминов и аспарагинов также появляется в этих спектрах в этом эксперименте. CBCA (CO) NH иногда более точно называют (HBHA) CBCA (CO) NH, поскольку он начинается с алифатических протонов и заканчивается амидным протоном, и поэтому не является постоянным экспериментом, как HN (CO) CACB.

HNCACB [ править ]

HNCACB или, альтернативно, CBCANH, коррелирует химический сдвиг амида остатка Cα и Cβ того же остатка, что и предыдущего остатка. [12] В каждой полоске могут быть видны четыре пика - 2 от одного и того же остатка и 2 от предыдущего остатка. Пики от предыдущего остатка обычно слабее и могут быть идентифицированы с помощью CBCA (CO) NH. В этом эксперименте пики Cα и Cβ находятся в противоположной фазе, т.е. если Cα появляется как положительный пик, то Cβ будет отрицательным, что упрощает идентификацию Cα и Cβ. Дополнительная информация о Cβ из серии экспериментов CBCA (CO) NH / HNCACB упрощает определение типа остатка, чем HN (CO) CA / HNCA, однако HNCACB является менее чувствительным экспериментом и может не подходить для некоторых белков.

Эксперимент CBCANH менее подходит для более крупного белка, поскольку он более подвержен проблеме ширины линии, чем HNCACB.

CBCACO (CA) HA [ править ]

Этот эксперимент обеспечивает связи между Cα и Cβ с карбонильным углеродом и атомами Hα в одном и том же остатке. [13] Карбоксильная группа боковой цепи аспартата и глутамата может проявляться слабо в этом спектре.

CC (CO) NH [ править ]

Этот эксперимент обеспечивает связь между амидом остатка и алифатическими атомами углерода предыдущего остатка. [14]

H (CCO) NH [ править ]

Этот эксперимент обеспечивает связь между амидом остатка и атомами водорода, присоединенными к алифатическому атому углерода предыдущего остатка.

HBHA (CO) NH [ править ]

Этот эксперимент коррелирует амидный резонанс с Hα и Hβ предыдущего остатка. [15]

Последовательное присвоение [ править ]

Для последовательного назначения обычно используются пары экспериментов, например, пара HNCACB и CBCA (CO) NH или HNCA и HNC (CO) CA. Спектры обычно анализируются как полосы пиков, и полосы из пары экспериментов могут быть представлены вместе рядом или как наложение двух спектров. В спектрах HNCACB обычно присутствуют 4 пика в каждой полосе, Cα и Cβ одного остатка, а также пика его предыдущего остатка. Пики от предыдущего остатка могут быть идентифицированы в эксперименте CBCA (CO) NH. Таким образом, каждая полоса пиков может быть связана со следующей полоской пиков из прилегающего остатка, что позволяет последовательно соединять полоски. Тип остатка можно определить по химическому сдвигу пиков, некоторые, например серин, треонин, глицин и аланин, идентифицировать намного легче, чем другие.Затем можно определить резонансы путем сравнения последовательности пиков с аминокислотной последовательностью белка.

Ссылки [ править ]

  1. ^ а б Икура М; Кей ЛЭ; Bax A (1990). «Новый подход к последовательному назначению спектров белков 1 H, 13 C и 15 N: трехмерная спектроскопия ЯМР с тройным гетероядерным резонансом. Применение к кальмодулину». Биохимия . 29 (19): 4659–67. DOI : 10.1021 / bi00471a022 . PMID  2372549 .
  2. ^ a b c Льюис Э. Кей; Мицухико Икура; Рольф Чудин, Ad Bax (1990). «Трехмерная тройная резонансная ЯМР-спектроскопия белков, обогащенных изотопами». Журнал магнитного резонанса . 89 (3): 496–514. Bibcode : 1990JMagR..89..496K . DOI : 10.1016 / 0022-2364 (90) 90333-5 .
  3. ^ a b Ad Bax (2011). «Трехмерный ЯМР белка с тройным резонансом: до того, как он стал черным ящиком» . Журнал магнитного резонанса . 213 (2): 442–5. Bibcode : 2011JMagR.213..442B . DOI : 10.1016 / j.jmr.2011.08.003 . PMC 3235243 . PMID 21885307 .  
  4. ^ а б Юнчао Су; Лорен Андреас и Роберт Г. Гриффин (2015). "ЯМР белков с вращением под магическим углом: высокочастотная динамическая поляризация ядра и обнаружение 1H". Ежегодный обзор биохимии . 84 : 485–497. DOI : 10.1146 / annurev-biochem-060614-034206 . PMID 25839340 .  - через Annual Reviews (требуется подписка)
  5. ^ Курт Вютрих (2001). «Путь к ЯМР-структурам белков». Структурная биология природы . 8 (11): 923–925. DOI : 10.1038 / nsb1101-923 . PMID 11685234 . S2CID 26153265 .  
  6. ^ Gabriele Varani; Фарид Абул-эла; Фредерик Аллен и Чарльз С. Габсер (1995). «Новые трехмерные эксперименты с тройным резонансом 1H - 13 C - 31 P для последовательных корреляций основной цепи в нуклеиновых кислотах». Журнал биомолекулярного ЯМР . 5 (3): 315–320. DOI : 10.1007 / BF00211759 . PMID 7540446 . S2CID 31239207 .  
  7. ^ Майкл Зальцманн; Герхард Уидер; Константин Первушин; Ханс Сенн и Курт Вултрих (1999). «Эксперименты с тройным резонансом типа TROSY для последовательного определения ЯМР больших белков» (PDF) . Журнал Американского химического общества . 121 (4): 844–848. DOI : 10.1021 / ja9834226 .
  8. ^ Барбет-Массин; и другие. (2014). «Быстрое назначение ЯМР с обнаружением протонов для белков с быстрым вращением под магическим углом» . Журнал Американского химического общества . 136 (35): 12489–12497. DOI : 10.1021 / ja507382j . PMC 4156866 . PMID 25102442 .  
  9. ^ Роберт Т. Клабб; В. Танабал; Герхард Вагнер (1992). «Трехмерная импульсная схема тройного резонанса с постоянным временем для корреляции химических сдвигов внутри остатка 1 H N , 15 N и 13 C 'в 15 N / 13 C-меченных белках». Журнал магнитного резонанса . 97 (1): 213–217. Bibcode : 1992JMagR..97..213C . DOI : 10.1016 / 0022-2364 (92) 90252-3 . ЛВП : 2027,42 / 30326 .
  10. ↑ Ad Bax & Mitsuhiko Ikura (1991). «Эффективный метод 3D ЯМР для корреляции протонных и 15 N амидных резонансов основной цепи с α-углеродом предыдущего остатка в белках, равномерно обогащенных 15 N / 13 C». Журнал биомолекулярного ЯМР . 1 (1): 99–104. DOI : 10.1007 / BF01874573 . PMID 1668719 . S2CID 20037190 .  
  11. ^ Stephan Grzesiek, Ad Вах (1992). «Корреляция резонансов амида основной цепи и боковой цепи в более крупных белках с помощью многократного ретрансляции тройного резонанса ЯМР». Журнал Американского химического общества . 114 (16): 6291–6293. DOI : 10.1021 / ja00042a003 .
  12. ^ Stephan Grzesiek, Ad Вах (1992). «Эффективный эксперимент для последовательного определения основной цепи изотопно-обогащенных белков среднего размера» . Журнал магнитного резонанса . 99 (1): 201–207. Bibcode : 1992JMagR..99..201G . DOI : 10.1016 / 0022-2364 (92) 90169-8 .
  13. ^ Кей, Льюис Э. (1993). «Трехмерный ЯМР-эксперимент с импульсным градиентом поля для корреляции химических сдвигов 13 Cα / β, 13 C 'и 1 Hα в однородно меченных углеродом-13 белках, растворенных в воде». Журнал Американского химического общества . 115 (5): 2055–2058. DOI : 10.1021 / ja00058a072 .
  14. ^ С. Гжесиек; Дж. Англистер; А. Бакс (1993). «Корреляция каркасных амидов и алифатических резонансов боковой цепи в белках, обогащенных 13 C / 15 N, путем изотропного смешения намагниченности 13 C» . Журнал магнитного резонанса, серии B . 101 (1): 114–119. Bibcode : 1993JMRB..101..114G . DOI : 10,1006 / jmrb.1993.1019 .
  15. ^ Stephan Grzesiek & Ad Вах (1993). «Определение типа аминокислот в процедуре последовательного определения однородно обогащенных 13 C / 15 N белков». Журнал биомолекулярного ЯМР . 3 (2): 185–204. DOI : 10.1007 / BF00178261 . PMID 8477186 . S2CID 1324255 .  

Внешние ссылки [ править ]

  • Эксперименты с тройным резонансом для белков
  • Введение в эксперименты с трехмерным тройным резонансом
  • ЯМР белков - Практическое руководство