Из Википедии, бесплатной энциклопедии
  (Перенаправлено с Vertico SMI )
Перейти к навигации Перейти к поиску

Двухцветная трехмерная микроскопия со сверхвысоким разрешением с Her2 и Her3 в клетках рака молочной железы, стандартные красители: Alexa 488, Alexa 568 - LIMON (SPDM + SMI

Вертико-пространственно-модулированное освещение ( Vertico-SMI ) - это самый быстрый [ необходима ссылка ] световой микроскоп для трехмерного анализа полных клеток в нанометровом диапазоне. Он основан на двух технологиях, разработанных в 1996 году: SMI (пространственно-модулированное освещение) и SPDM (спектральная прецизионная дистанционная микроскопия). Эффективное оптическое разрешение этого оптического наноскопа достигло 5 нм в 2D и 40 нм в 3D, что значительно превышает предел разрешения λ / 2 (около 200 нм для синего света), применяемый в стандартной микроскопии с использованием пропускания или отражения естественного света. (в отличие от структурированного освещения или флуоресценции ) в соответствии сПредел разрешения Аббе [1] Этот предел (также известный как предел Рэлея ) был определен Эрнстом Аббе в 1873 году и определяет достижимый предел разрешения микроскопов с использованием обычных методов.

Vertico-ГИУ микроскоп был разработан группой под руководством Кристофа Кремер , почетный [2] в Гейдельбергском университете , и основан на сочетании света оптических методов локализации микроскопии (SPDM, спектральная точность расстояния микроскопии ) и структурированной подсветки (ГИУ, пространственно-модулированное освещение ).

С марта 2008 года многие стандартные флуоресцентные красители, такие как флуоресцентные красители GFP и Alexa, могут использоваться с этой так называемой локализационной микроскопией SPDMphymod (физически изменяемые флуорофоры), для которой достаточно только одной длины волны лазера подходящей интенсивности для наноизображения.

Конфигурация [ править ]

SMI означает особый тип лазерного оптического освещения ( пространственно-модулированное освещение ), а Vertico отражает вертикальное расположение оси микроскопа, что делает возможным анализ фиксированных клеток, а также живых клеток с оптическим разрешением ниже 10 нанометров (1 нанометр = 1 нм = 1 × 10 -9  м).

Особенностью этой технологии по сравнению с методами фокусировки, такими как микроскопия 4Pi , является широкое поле экспозиции, которое позволяет отображать целые клетки в наномасштабе. Для такого трехмерного экспонирования целой клетки с типичным размером объекта 20 мкм × 20 мкм требуется всего 2 минуты. Экспозиции с широким полем означают, что весь объект освещается и обнаруживается одновременно.

Пространственно модулированное освещение [ править ]

SMI + TIRF ткани глаза человека, пораженной дегенерацией желтого пятна

SMI-микроскопия - это светооптический процесс так называемой технологии рассеяния точки. Это процессы, которые изменяют функцию рассеяния точки (PSF) микроскопа подходящим образом, чтобы либо увеличить оптическое разрешение, либо максимизировать точность измерения расстояния до флуоресцентных объектов, которые малы по сравнению с длиной волны освещающего света, либо извлечь другие структурные параметры в нанометровом диапазоне.

Микроскоп SMI, разрабатываемый в Физическом институте Кирхгофа при Гейдельбергском университете, достигает этого следующим образом: интенсивность освещения в пределах диапазона объектов неоднородна, в отличие от обычных широкопольных флуоресцентных микроскопов, но пространственно модулируется точным образом за счет использования двух противоположных мешающих лазерных лучей вдоль оси. Принцип пространственно-модулированного волнового поля был разработан в 1993 г. Бейли и др. Подход микроскопии SMI, используемый в приложении Heidelberg, перемещает объект с высокой точностью шагами через волновое поле, или само волновое поле перемещается относительно объекта за счет фазового сдвига. Это приводит к улучшенному осевому размеру и разрешающей способности по расстоянию. [3] [4]

SMI можно комбинировать с другими технологиями сверхвысокого разрешения, например, с 3D LIMON или LSI- TIRF в качестве интерферометра полного внутреннего отражения с боковым структурированным освещением. Этот метод SMI позволил получить светооптические изображения распределения автофлуорофоров в срезах ткани глаза человека с непревзойденным ранее оптическим разрешением. Использование трех различных длин волн возбуждения (488, 568 и 647 нм) позволяет собирать спектральную информацию о сигнале автофлуоресценции. Это было использовано для тканей глаза человека, пораженных дегенерацией желтого пятна AMD. [5]

СПДМ: микроскопия локализации [ править ]

Микроскопия одиночной молекулы YFP со сверхвысоким разрешением / SPDMphymod

Одиночный крошечный источник света может быть обнаружен намного лучше, чем разрешение микроскопа: хотя свет будет давать размытое пятно, можно использовать компьютерные алгоритмы для точного расчета центра размытого пятна с учетом функции рассеяния точки. микроскопа, шумовых свойств детектора и т. д. Однако этот подход не работает, когда слишком много источников близко друг к другу: все источники размываются вместе.

SPDM (спектральная прецизионная дистанционная микроскопия) - это семейство методов флуоресцентной микроскопии, которое позволяет обойти эту проблему, измеряя всего несколько источников одновременно, так что каждый источник «оптически изолирован» от других (т.е. разрешение микроскопа, обычно ~ 200-250 нм). [6] [7] [8] Затем можно использовать описанный выше метод (нахождение центра каждого размытого пятна).

Если молекулы имеют множество различных спектров (спектры поглощения и / или спектры излучения), то можно наблюдать за светом всего нескольких молекул за раз, используя соответствующие источники света и фильтры. Молекулы также можно различать более тонкими способами на основе времени жизни флуоресценции и других методов. [6]

Структурное разрешение, достигаемое с помощью SPDM, может быть выражено через наименьшее измеряемое расстояние между двумя в их пространственном положении определенными точечными частицами с разными спектральными характеристиками («топологическое разрешение»). Моделирование показало, что при подходящих условиях, касающихся точности локализации, плотности частиц и т. Д., «Топологическое разрешение» соответствует « пространственной частоте », которая в терминах классического определения эквивалентна значительно улучшенному оптическому разрешению.

SPDM - это локализационная микроскопия, которая обеспечивает эффективное оптическое разрешение в несколько раз лучше, чем обычное оптическое разрешение (примерно 200–250 нм), представленное полушириной основного максимума функции эффективного точечного изображения. Применяя подходящие лазерные оптические прецизионные процессы, положение и расстояния, значительно меньшие, чем полуширина функции рассеяния точки (обычно 200–250 нм), могут быть измерены с нанометровой точностью между целями с различными спектральными характеристиками. [6] Важной областью применения являются исследования генома (изучение функциональной организации генома ). Еще одна важная область использования - это исследование структуры мембран.

Одной из наиболее важных основ локализационной микроскопии в целом является первая экспериментальная работа по локализации флуоресцентных объектов в наномасштабе (3D) в 1996 году [9] и теоретическое и экспериментальное доказательство точности локализации с использованием видимого света в диапазоне 1 нм - основа для локализационной микроскопии лучше 1/100 длины волны. [10] [11]

SPDMphymod: стандартные флуоресцентные красители в мигающем режиме типа GFP [ править ]

Двухцветная локализационная микроскопия SPDMфимод / микроскопия сверхвысокого разрешения с использованием гибридных белков GFP и RFP

Только в последние два года в наноскопических исследованиях использовались молекулы, которые излучают одну и ту же спектральную частоту света (но с разными спектральными характеристиками в зависимости от характеристик мигания), но которые можно включать и выключать с помощью света, что необходимо для спектральной точности. дистанционная микроскопия. Комбинируя многие тысячи изображений одной и той же клетки, стало возможным использовать лазерные оптические прецизионные измерения для записи изображений локализации со значительно улучшенным оптическим разрешением. Применение этих новых процессов наноскопии до недавнего времени казалось очень трудным, поскольку предполагалось, что только специально изготовленные молекулы можно включать и выключать подходящим образом с помощью света.

В марте 2008 года лаборатория Кристофа Кремера обнаружила, что это также возможно для многих стандартных флуоресцентных красителей, таких как GFP , красители Alexa и молекулы флуоресцеина, при наличии определенных фотофизических условий. Используя эту так называемую технологию SPDMphymod (физически изменяемые флуорофоры), для создания наноизображений достаточно одной длины волны лазера подходящей интенсивности. В отличие от других локализационных микроскопов, когда используются специальные фотопереключаемые / фотоактивируемые молекулы флуоресценции, для которых необходимы две длины волны лазера. [12]

Ген GFP был введен и экспрессирован во многих прокариотических и эукариотических клетках, и Нобелевская премия по химии 2008 г. была присуждена Мартину Чалфи , Осаму Шимомуре и Роджеру Й. Циену за открытие и разработку зеленого флуоресцентного белка. Открытие того, что эти стандартные флуоресцентные молекулы могут быть использованы, расширяет применимость метода SPMD к многочисленным областям исследований в биофизике , клеточной биологии и медицине .

Стандартные флуоресцентные красители уже успешно используются с технологией SPDMphymod: GFP, RFP, YFP, Alexa 488, Alexa 568, Alexa 647, Cy2, Cy3, Atto 488 и флуоресцеин.

LIMON: 3D микроскопия со сверхвысоким разрешением [ править ]

LIMON (Light MicrOscopical nanosize microscopy) был изобретен в 2001 году в Гейдельбергском университете и сочетает в себе локализационную микроскопию и пространственно-модулированное освещение с трехмерной микроскопией сверхвысокого разрешения.

Трехмерные изображения с использованием Vertico-SMI стали возможными благодаря комбинации SMI и SPDM, при этом сначала применяется SMI, а затем процесс SPDM. Процесс SMI определяет центр частиц и их разброс в направлении оси микроскопа. Хотя центр частиц / молекул может быть определен с точностью до 1-2 нм, разброс вокруг этой точки может быть определен вплоть до осевого диаметра прибл. 30-40 нм.

Затем с помощью SPDM определяется поперечное положение отдельных частиц / молекул с точностью до нескольких нанометров. В настоящее время SPDM достигает 16 кадров / сек с эффективным разрешением 10 нм в 2D (плоскость объекта); приблизительно 2000 таких кадров комбинируются с данными SMI (время сбора данных около 10 секунд) для получения трехмерного изображения с наивысшим разрешением (эффективное оптическое разрешение 3D составляет около 40-50 нм). С более быстрой камерой можно ожидать еще более высоких скоростей (до нескольких сотен кадров в секунду, в стадии разработки). Используя подходящие красители, можно добиться еще более высокого эффективного оптического 3D разрешения [13]

Комбинируя SPDMphymod с SMI (оба из которых были изобретены в лаборатории Кристофа Кремера в 1996 году), была достигнута трехмерная двухцветная реконструкция пространственного расположения кластеров Her2 / neu и Her3. Положения во всех трех направлениях кластеров белка можно было определить с точностью около 25 нм. [14]

Использование микроскопии сверхвысокого разрешения в промышленности [ править ]

Несмотря на то, что технологии сверхвысокого разрешения используются в биомедицинских лабораториях, они могут служить важным инструментом в фармацевтических исследованиях. Они могут быть особенно полезны при идентификации и оценке целей. Например, биомолекулярные машины (БММ) представляют собой очень сложные наноструктуры, состоящие из нескольких больших молекул и отвечающие за основные функции в клетках организма. В зависимости от своего функционального статуса они имеют определенную трехмерную структуру. Примерами биомолекулярных машин являются нуклеосомы, которые позволяют ДНК, носителю генетической информации длиной два метра, складываться в клетках тела всего на несколько миллионных миллиметра в диаметре. Следовательно, ДНК может служить центром информации и управления.

Используя LIMON 3D в сочетании с комплексной маркировкой LIMON, можно впервые сделать видимыми скрытые белки или нуклеиновые кислоты трехмерного молекулярного комплекса так называемых биомолекулярных машин без разрушения комплекса. До сих пор проблема в большинстве случаев заключалась в том, что комплекс необходимо было разрушить для детального анализа отдельных макромолекул в нем. В качестве альтернативы для визуализации трехмерной структуры таких комплексов использовались модели виртуального компьютерного моделирования или дорогостоящие методы ядерного магнитного резонанса. [15]

Литература [ править ]

  1. ^ Рейманн, J; Baddeley, D; Гункель, М; Lemmer, P; Стадтер, Вт; Jegou, T; Риппе, К; Cremer, C; Бирк, У (2008). «Высокоточный структурный анализ субядерных комплексов в фиксированных и живых клетках с помощью микроскопии с пространственно-модулированным освещением (SMI)» . Хромосомные исследования . 16 (3): 367–82. DOI : 10.1007 / s10577-008-1238-2 . PMID  18461478 .
  2. ^ "Fakultät für Physik und Astronomie" .
  3. ^ Heintzmann Р., Кремер К. (1999). «Микроскопия с боковым модулированным возбуждением: улучшение разрешения с помощью дифракционной решетки ». Proc. ШПИОН . 3568 : 185–196. Bibcode : 1999SPIE.3568..185H . Doi : 10.1117 / 12.336833 . S2CID 128763403 . 
  4. ^ Патент США 7342717: Кристоф Кремер, Майкл Хаусман, Joachim Bradl, Bernhard Schneider волнового поля микроскоп с функцией точки обнаружения распространения , дата приоритета 10 июля 1997
  5. ↑ Best G, Amberger R, Baddeley D, Ach T, Dithmar S, Heintzmann R, Cremer C (2011). «Структурированная световая микроскопия автофлуоресцентных скоплений в тканях человека». Микрон . 42 (4): 330–335. DOI : 10.1016 / j.micron.2010.06.016 . PMID 20926302 . CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  6. ^ a b c Леммер П., Гункель М., Баддели Д., Кауфманн Р., Урих А., Вейланд Ю., Рейманн Дж., Мюллер П., Хаусманн М., Кремер С. (2008). «SPDM: световая микроскопия с разрешением отдельных молекул на наноуровне» (PDF) . В прикладной физике . 93 (1): 1–12. Bibcode : 2008ApPhB..93 .... 1L . DOI : 10.1007 / s00340-008-3152-х . S2CID 13805053 .  CS1 maint: uses authors parameter (link)
  7. ^ М. ван Oijen, J Келер, J Шмидт, М Мюллер, Г. J Brakenhoff (31 июля 1998 года). «Трехмерное сверхвысокое разрешение за счет спектрально-селективной визуализации» (PDF) . Письма по химической физике . 292 (1-2): 183–187. Bibcode : 1998CPL ... 292..183V . DOI : 10.1016 / S0009-2614 (98) 00673-3 . CS1 maint: uses authors parameter (link)
  8. ^ Bornfleth, Sätzler, Eils, Кремер (1 февраля 1998). «Высокоточные измерения расстояний и сегментация объектов с сохранением объема вблизи и ниже предела разрешения в трехмерной конфокальной флуоресцентной микроскопии». Журнал микроскопии . 189 (2): 118–136. DOI : 10.1046 / j.1365-2818.1998.00276.x . S2CID 73578516 . CS1 maint: uses authors parameter (link)
  9. ^ Bradl Дж, Rinke Б., Эс А., Эдельманн П., Кригер Г., Шнайдер Б., Hausmann М., Кремер С. (1996). Бигио, Ирвинг Дж; Grundfest, Warren S; Шнекенбургер, Герберт; Сванберг, Катарина; Виалле, Пьер М. (ред.). «Сравнительное исследование точности трехмерной локализации в традиционной, конфокальной лазерной сканирующей и аксиалтомографической флуоресцентной световой микроскопии». Proc. ШПИОН . Оптическая биопсия и микроскопические методы. 2926 : 201–206. Bibcode : 1996SPIE.2926..201B . DOI : 10.1117 / 12.260797 . S2CID 55468495 . CS1 maint: multiple names: authors list (link)
  10. ^ Heintzmann Р., Мюнх Г., Кремер С. (1997). «Высокоточные измерения в эпифлуоресцентной микроскопии - моделирование и эксперимент». Cell Vision . 4 : 252–253.CS1 maint: multiple names: authors list (link)
  11. ^ Патент США 6424421: Кристоф Кремер, Майкл Хаусман, Joachim Bradl Бернд Rinke Способ и устройство для измерения расстояний между объектными структурами , датой приоритета 23 декабря 1996
  12. ^ Manuel Гункель, Fabian Erdel, Карстен Rippe, Пол Леммер, Райнер Кауфман, Кристоф Hörmann, Роман Amberger и Кристоф Кремер (2009): Двойная локализация цвета микроскопия клеточных наноструктур . В: Журнал биотехнологии, 2009, 4, 927-938. ISSN 1860-6768 
  13. ^ Baddeley D, Batram C, Weiland Y, Cremer C, Birk UJ .: Анализ наноструктуры с использованием микроскопии пространственно-модулированного освещения . В: Протоколы природы 2007; 2: 2640–2646
  14. ^ Кауфманн Райнер, Мюллер Патрик, Хильденбранд Георг, Хаусманн Михаэль, Кремер Кристоф (2010). «Анализ кластеров мембранного белка Her2 / neu в различных типах клеток рака молочной железы с использованием микроскопии локализации». Журнал микроскопии . 242 (1): 46–54. DOI : 10.1111 / j.1365-2818.2010.03436.x . PMID 21118230 . S2CID 2119158 .  CS1 maint: multiple names: authors list (link)
  15. ^ Микроскопия сверхвысокого разрешения для фармацевтической промышленности: выданы патенты на трехмерную сложную маркировку. Архивировано 9 января 2012 г. на Wayback Machine.

Внешние ссылки [ править ]

  • GFP сверхразрешение
  • Список публикаций оптическая наноскопия
  • пресс-релиз Гейдельбергского университета
  • Лазерная оптическая наноскопия измерения сверхразрешения