Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Аспартат карбамоилтрансфераза
Апартат-карбамоилтрансфераза-pdb-2ATC.png
Аспартаткарбамоилтрансфераза из Escherichia coli . PDB 2ATC.
Идентификаторы
Номер ЕС2.1.3.2
Количество CAS9012-49-1
Базы данных
IntEnzПросмотр IntEnz
BRENDABRENDA запись
ExPASyПросмотр NiceZyme
КЕГГЗапись в KEGG
MetaCycметаболический путь
ПРИАМпрофиль
Структуры PDB RCSB PDB PDBe PDBsum
Генная онтологияAmigo / QuickGO
Поиск
ЧВКстатьи
PubMedстатьи
NCBIбелки
Человеческая карбамоилфосфатсинтетаза 2, аспартат-транскарбамоилаза, дигидрооротаза
Идентификаторы
СимволCAD
Ген NCBI790
HGNC1424
OMIM114010
RefSeqNM_004341
UniProtP27708
Прочие данные
Номер ЕС2.1.3.2
LocusChr. 2 п22-п21
Ищи
СтруктурыШвейцарская модель
ДоменыИнтерПро

Аспартат-карбамоилтрансфераза (также известная как аспартат-транскарбамоилаза или ATCase ) катализирует первую стадию пути биосинтеза пиримидина ( EC 2.1.3.2 ). [1]

В E. coli фермент представляет собой мультисубъединичный белковый комплекс, состоящий из 12 субъединиц (всего 300 кДа). [2] Состав субъединиц C 6 R 6 , образующий 2 тримеров каталитических субъединиц (34 кДа) и 3 димера регуляторных субъединиц (17 кДа). Особое расположение каталитических и регуляторных субъединиц в этом ферменте обеспечивает комплекс с сильно аллостерическим поведением по отношению к его субстратам. [3] Фермент является типичным примером аллостерической модуляции тонкого контроля метаболических ферментативных реакций.

ATCase не следует кинетике Михаэлиса-Ментен . Напротив, он находится между его «напряженным» с низкой активностью и низким сродством и его «расслабленным» состоянием с высокой активностью и высоким сродством. [4] Связывание субстрата с каталитическими субъединицами приводит к сдвигу равновесия в сторону R-состояния, тогда как связывание CTP с регуляторными субъединицами приводит к сдвигу равновесия в сторону T-состояния. Связывание АТФ с регуляторными субъединицами приводит к сдвигу равновесия в сторону R-состояния. [5]

Реакция [ править ]

ATCase - это строго регулируемый фермент, который катализирует первую обязательную стадию биосинтеза пиримидина, конденсацию 1-аспартата и карбамоилфосфата с образованием N-карбамил-L-аспартата и неорганического фосфата . Катализ ATCase служит лимитирующим этапом в биосинтезе пиримидина, потому что он изменяет его каталитическую скорость в ответ на клеточные уровни как пиримидинов, так и пуринов . Конечный продукт пиримидинового пути, CTP , снижает каталитическую скорость, тогда как ATP , конечный продукт параллельного пуринового пути, увеличивает каталитическую скорость.

Структура [ править ]

Схематическая диаграмма структуры ATCase, изображающая пространственное расположение зеленых регуляторных (R) и синих каталитических (C) субъединиц. Перерисовано и изменено из Ke et al. , 1984. [6]

Обсуждение структуры, каталитического центра, и аллостерического сайта , который следует на основе прокариотических версии ATCase, в частности E. Co ' с.

Ранние исследования показали, что ATCase состоит из двух разных типов полипептидных цепей, которые играют разные роли. [7] каталитические субъединицы катализирует карбамилированием аминогруппы группы аспартат , но не имеют регуляторные свойства, в то время как регуляторные субъединицы не имеют каталитическую активность , но содержат регуляторные участки для связывания эффектора. ATCase Голоэнзит состоит из двух каталитических тримеров , которые находятся в контакте , и удерживаемые вместе тремя регуляторных димерами, так что нативная форма фермента содержит шесть цепей каждого типа, с общей молекулярной массой 310 кДа .

Каждый из каталитических доменов состоит из двух структурных доменов: аспартатного домена, который содержит большинство остатков, ответственных за связывание аспартата , и карбамоилфосфатного домена, который содержит большинство остатков, связывающихся с карбамоилфосфатом . Каждый регуляторный домен также состоит из двух доменов: аллостерического домена, который имеет сайт связывания для эффекторов нуклеотидов , и цинкового домена, состоящего из четырех остатков цистеина, сгруппированных в его С-концевом участке . Эти остатки координат на цинк атомэто не участвует в каком-либо каталитическом свойстве, но, как было показано, важно для ассоциации регуляторных и каталитических субъединиц. [8]

Трехмерное расположение каталитических и регуляторных субъединиц включает несколько ионных и гидрофобных стабилизирующих контактов между аминокислотными остатками. [6] Каждая каталитическая цепь находится в контакте с тремя другими каталитическими цепями и двумя регуляторными цепями. Каждый регуляторный мономер контактирует с одной другой регуляторной цепью и двумя каталитическими цепями. В несвязанном ферменте два каталитических тримера также находятся в контакте.

Каталитический центр [ править ]

Каталитический сайт ATCase расположен на границе раздела между двумя соседними каталитическими цепями в одном и том же тримере и включает боковые цепи аминокислот из обеих этих субъединиц. Понимание способа связывания субстратов с каталитическим центром ATCase впервые стало возможным благодаря связыванию аналога бисубстрата, N- (фосфоноацетил) -L-аспартата (PALA). [9] Это соединение является сильным ингибитором ATCase и имеет структуру, которая, как полагают, очень близка к структуре переходного состояния субстратов. [10] Кроме того, были получены кристаллические структуры ATCase, связанные с карбамоилфосфатом и сукцинатом. [11]Эти исследования, в дополнение к исследованиям с использованием сайт-направленного мутагенеза конкретных аминокислот, идентифицировали несколько остатков, которые имеют решающее значение для катализа, таких как Ser52, Thr53, Arg54, Thr55, Arg105, His134, Gln137, Arg167, Arg229, Glu231 и Ser80 и Lys84 из соседней каталитической цепи. Активный сайт - это сильно заряженный карман. Одна из наиболее важных боковых цепей происходит из Arg54, который взаимодействует с концевым кислородом и кислородом ангидрида карбамоилфосфата, стабилизируя отрицательный заряд уходящей фосфатной группы. Arg105, His134 и Thr55 помогают увеличить электрофильность карбонильного углерода за счет взаимодействия с карбонильным кислородом. [7] В общем, увеличение скорости ATCase достигается за счет ориентации и стабилизации субстратов, промежуточных продуктов и продуктов, а не за счет прямого участия аминокислотных остатков в каталитическом механизме.

Аллостерический сайт [ править ]

Аллостерический сайт в аллостерическом домене R-цепей комплекса ATCase связывается с нуклеотидами АТФ, CTP и / или UTP. В каждом регуляторном димере есть один сайт с высоким сродством к АТФ и CTP и один с 10-20 раз меньшим сродством к этим нуклеотидам. [7] АТФ связывается преимущественно с сайтами с высоким сродством и впоследствии активирует фермент, в то время как связывание UTP и CTP приводит к ингибированию активности. UTP может связываться с аллостерическим сайтом, но ингибирование ATCase с помощью UTP возможно только в сочетании с CTP. При наличии CTP связывание UTP усиливается и предпочтительно направляется на сайты с низким сродством. Напротив, связывание UTP приводит к увеличению сродства к CTP в сайтах с высоким сродством, и вместе они ингибируют активность фермента до 95%, в то время как связывание CTP само по себе ингибирует активность до 50-70%. [3]Сравнение кристаллических структур T- и R-форм ATCase показывает, что она увеличивается в размерах во время аллостерического перехода, и что каталитические субъединицы конденсируются во время этого процесса. Два каталитических тримера раздвигаются вдоль оси третьего порядка на 12 Å, и они вращаются вокруг этой оси на 5 ° каждый, что в конечном итоге приводит к переориентации регуляторных субъединиц вокруг своей оси второго порядка на 15 °. [12] Это изменение четвертичной структуры связано с изменениями межсубъединичных и междоменных взаимодействий. Взаимодействие между субъединицами C1-C4 и R1 во время этого преобразования сильно модифицируется. В частности, наблюдается большое перемещение аминокислотных остатков 230–254, известных под общим названием «петля 240». Эти остатки расположены в щели междукарбамоилфосфатный и аспартатный домены на границе С1-С4. Общий результат этих структурных изменений состоит в том, что два домена каждой каталитической цепи сближаются, обеспечивая лучший контакт с субстратами или их аналогами .

Во время этого структурного перехода некоторые взаимодействия между боковыми цепями теряются, а некоторые другие устанавливаются. Исследования подтвердили, что положение петли 240s напрямую влияет на связывание субстрата в соответствующем активном сайте. [13] Более ранние исследования с использованием сайт-направленного мутагенеза 240s петли показали, что взаимодействия между Asp271 и Tyr240, а также между Glu239 из C1 и Tyr165 из C4 будут стабилизировать Т-состояние, в то время как взаимодействия между Glu239 из C1 и Lys164 и Tyr165 из C4 стабилизирует R-состояние. [14]

Расположенная близко к 240s петле и активному сайту, область петли, охватывающая остатки 160–166, играет роль как во внутренней архитектуре фермента, так и в его регуляторных свойствах. [15] В частности, остаток Asp162 взаимодействует с Gln231 (известно, что он участвует в связывании аспартата) и связывает одни и те же остатки как в T, так и в R-состояниях. Мутант, у которого этот остаток был мутирован в аланин, показал огромное снижение специфической активности, двукратное снижение сродства к аспартату , потерю гомотропной кооперативности и снижение активации АТФ.. Было высказано предположение, что изменение общей структуры, вызванное введением этого остатка, влияет на другие остатки в интерфейсах R1-C1, R1-C4 и C1-C4, которые участвуют в переходе четвертичной структуры . [16]

Монтаж комплекса [ править ]

Регуляторные и каталитические субъединицы существуют как гомологи слитых белков, что дает убедительные доказательства того, что они будут взаимодействовать друг с другом. [17] Два каталитических тримера и два регуляторных димера собираются с образованием промежуточного соединения аспартат-карбамоилтрансферазы, состоящего из 6 каталитических субъединиц и 4 регуляторных субъединиц. [18]

Ссылки [ править ]

  1. ^ Тушить JP, Келли RE, Ринкер AG, Zimmermann BH, Скалли JL, Ким H, Evans DR (январь 1990). «Дигидрооротаза млекопитающих: нуклеотидная последовательность, пептидные последовательности и эволюция дигидрооротазного домена многофункционального белка CAD» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 87 (1): 174–8. DOI : 10.1073 / pnas.87.1.174 . PMC  53223 . PMID  1967494 .
  2. ^ Macol CP, Tsuruta H, Стец B, Kantrowitz ER (май 2001). «Прямые структурные доказательства согласованного аллостерического перехода в аспартат-транскарбамоилазе Escherichia coli». Структурная биология природы . 8 (5): 423–6. DOI : 10.1038 / 87582 . PMID 11323717 . S2CID 35403933 .  
  3. ^ a b Helmstaedt K, Krappmann S, Braus GH (сентябрь 2001 г.). «Аллостерическая регуляция каталитической активности: аспартат-транскарбамоилаза Escherichia coli против хризматмутазы дрожжей» . Обзоры микробиологии и молекулярной биологии . 65 (3): 404–21, содержание. DOI : 10.1128 / MMBR.65.3.404-421.2001 . PMC 99034 . PMID 11528003 .  
  4. ^ Биохимия, Кэмпбелл и Фаррел, Глава 7
  5. ^ Альбертс, Брюс, автор. Молекулярная биология клетки . ISBN 978-1-315-73536-8. OCLC  1082214404 .CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  6. ^ a b Ke HM, Honzatko RB, Lipscomb WN (июль 1984 г.). «Структура нелигированной аспартаткарбамоилтрансферазы Escherichia coli при разрешении 2,6 Å» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 81 (13): 4037–40. DOI : 10.1073 / pnas.81.13.4037 . PMC 345363 . PMID 6377306 .  
  7. ^ а б в Липскомб WN (1994). «Аспартат-транскарбамилаза из Escherichia coli: активность и регуляция». Достижения в энзимологии и смежных областях молекулярной биологии . Достижения в энзимологии и смежных областях молекулярной биологии. 68 . С. 67–151. DOI : 10.1002 / 9780470123140.ch3 . ISBN 9780470123140. PMID  8154326 .
  8. ^ Kantrowitz ER, Lipscomb WN (август 1988). «Аспартат-транскарбамилаза Escherichia coli: взаимосвязь между структурой и функцией». Наука . 241 (4866): 669–74. DOI : 10.1126 / science.3041592 . PMID 3041592 . 
  9. ↑ Krause KL, Volz KW, Lipscomb WN (февраль 1987 г.). «2.5 Структура аспартат-карбамоилтрансферазы в комплексе с бисубстратным аналогом N- (фосфонацетил) -L-аспартатом». Журнал молекулярной биологии . 193 (3): 527–53. DOI : 10.1016 / 0022-2836 (87) 90265-8 . PMID 3586030 . 
  10. Перейти ↑ Wang J, Stieglitz KA, Cardia JP, Kantrowitz ER (июнь 2005 г.). «Структурная основа для упорядоченного связывания субстрата и кооперативности в аспартат-транскарбамоилазе» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 102 (25): 8881–6. DOI : 10.1073 / pnas.0503742102 . PMC 1157055 . PMID 15951418 .  
  11. ^ Gouaux JE, Lipscomb WN (июнь 1988). «Трехмерная структура карбамоилфосфата и сукцината, связанного с аспартат-карбамоилтрансферазой» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 85 (12): 4205–8. DOI : 10.1073 / pnas.85.12.4205 . PMC 280395 . PMID 3380787 .  
  12. ^ Kantrowitz ER, Lipscomb WN (февраль 1990). «Аспартат-транскарбамоилаза Escherichia coli: молекулярная основа согласованного аллостерического перехода». Направления биохимических наук . 15 (2): 53–9. DOI : 10.1016 / 0968-0004 (90) 90176-C . PMID 2186515 . 
  13. ^ Fetler L, Vachette P, Эрве G, Ladjimi MM (декабрь 1995). «В отличие от перехода четвертичной структуры, изменение третичной структуры 240s петли в аллостерической аспартаттранскарбамилазе требует насыщения активного сайта субстратом для завершения». Биохимия . 34 (48): 15654–60. DOI : 10.1021 / bi00048a008 . PMID 7495794 . 
  14. ^ Мидлтон SA, Kantrowitz ER (август 1986). «Важность петли на остатках 230–245 в аллостерических взаимодействиях аспартат карбамоилтрансферазы Escherichia coli» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 83 (16): 5866–70. DOI : 10.1073 / pnas.83.16.5866 . PMC 386397 . PMID 3526342 .  
  15. ^ Ньютон CJ, Stevens RC, Kantrowitz ER (март 1992). «Важность консервативного остатка аспартата-162 для функции аспартат-транскарбамоилазы Escherichia coli». Биохимия . 31 (11): 3026–32. DOI : 10.1021 / bi00126a026 . PMID 1550826 . 
  16. ^ Fetler L, Тауца P, Baker DP, Macol CP, Kantrowitz ER, Vachette P (май 2002). «Замена Asp-162 на Ala предотвращает кооперативный переход субстратов, одновременно усиливая действие аллостерического активатора АТФ на аспартат-транскарбамоилазу E. coli» . Белковая наука . 11 (5): 1074–81. DOI : 10.1110 / ps.4500102 . PMC 2373563 . PMID 11967364 .  
  17. ^ Marsh JA, Эрнандеса H, Z Hall, Ahnert SE, Perica T, Робинсон CV, Teichmann SA (апрель 2013). «Белковые комплексы подвергаются эволюционному отбору и собираются упорядоченными путями» . Cell . 153 (2): 461–470. DOI : 10.1016 / j.cell.2013.02.044 . PMC 4009401 . PMID 23582331 .  
  18. ↑ Evans DR, Pastra-Landis SC, Lipscomb WN (апрель 1974). «Промежуточный комплекс в диссоциации аспартат-транскарбамилазы» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 71 (4): 1351–5. DOI : 10.1073 / pnas.71.4.1351 . PMC 388226 . PMID 4598300 .  

Внешние ссылки [ править ]

  • Аспартат + карбамоилтрансфераза в Национальной медицинской библиотеке США по медицинским предметным рубрикам (MeSH)