Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Рисунок 1: Схема преобразования бисульфита последовательности образца геномной ДНК. Нуклеотиды синего цвета - это неметилированные цитозины, превращенные в урацилы бисульфитом, а красные нуклеотиды - это 5-метилцитозины, устойчивые к превращению.
Рисунок 2: Схема химической реакции, лежащей в основе катализируемого бисульфитом превращения цитозина в урацил.

Бисульфитное [1] секвенирование (также известное как бисульфитное секвенирование ) - это использование бисульфитной обработки ДНК перед рутинным секвенированием для определения характера метилирования . Метилирование ДНК было первой обнаруженной эпигенетической меткой и остается наиболее изученной. У животных он преимущественно включает добавление метильной группы к положению углерода-5 цитозиновых остатков динуклеотида CpG и участвует в подавлении транскрипционной активности .

Обработка ДНК бисульфитом превращает остатки цитозина в урацил , но не затрагивает остатки 5-метилцитозина . Следовательно, ДНК, обработанная бисульфитом, сохраняет только метилированные цитозины. Таким образом, обработка бисульфитом приводит к специфическим изменениям в последовательности ДНК, которые зависят от статуса метилирования отдельных остатков цитозина, что дает однонуклеотидную разрешающую информацию о статусе метилирования сегмента ДНК. Для получения этой информации можно выполнить различные анализы измененной последовательности. Таким образом, цель этого анализа сводится к различению однонуклеотидных полиморфизмов (цитозины и тимидин).) в результате преобразования бисульфита (Рисунок 1).

Методы [ править ]

В бисульфитном секвенировании используются стандартные методы секвенирования геномной ДНК, обработанной бисульфитом, для определения статуса метилирования динуклеотидов CpG. Другие стратегии, не связанные с секвенированием, также используются для исследования метилирования в конкретных локусах или на уровне всего генома . Все стратегии предполагают, что индуцированное бисульфитом превращение неметилированных цитозинов в урацил завершено, и это служит основой для всех последующих методик. В идеале используемый метод должен определять статус метилирования отдельно для каждого аллеля . Методы, альтернативные бисульфитному секвенированию, включают комбинированный анализ рестрикции бисульфита и иммунопреципитацию метилированной ДНК (MeDIP).

Методики анализа ДНК, обработанной бисульфитом, постоянно развиваются. Чтобы обобщить эти быстро развивающиеся методологии, было написано множество обзорных статей. [2] [3] [4] [5]

В целом методологии можно разделить на стратегии, основанные на ПЦР, специфичной для метилирования (MSP) (рис. 4), и стратегии, использующие полимеразную цепную реакцию (ПЦР), выполняемую в условиях, не связанных с метилированием (рис. 3). В методах на основе микрочипов также используется ПЦР, основанная на условиях, не связанных с метилированием.

Методы, не связанные с метилированием, на основе ПЦР [ править ]

Рисунок 3: Методы анализа метилирования ДНК, не основанные на ПЦР, специфичной для метилирования. После превращения бисульфита геномная ДНК амплифицируется с помощью ПЦР, которая не различает метилированные и неметилированные последовательности. Затем используются многочисленные доступные методы для определения различий на основе изменений внутри ампликона в результате преобразования бисульфита.

Прямая последовательность [ править ]

Первый опубликованный метод анализа метилирования с использованием ДНК, обработанной бисульфитом, использовал ПЦР и стандартное секвенирование дидезоксинуклеотидной ДНК для прямого определения нуклеотидов, устойчивых к превращению бисульфита. [6] Праймеры разработаны так, чтобы быть специфичными для цепи, а также специфичными для бисульфита (т.е. праймеры, содержащие цитозины, не относящиеся к CpG, так что они не комплементарны ДНК, не обработанной бисульфитом), фланкируя (но не вовлекая) сайт метилирования. представляет интерес. Следовательно, он будет амплифицировать как метилированные, так и неметилированные последовательности, в отличие от специфичной для метилирования ПЦР. Все сайты неметилированных цитозинов отображаются как тимины в результирующей амплифицированной последовательности смысловой цепи и как аденины в амплифицированной последовательности.антисмысловая нить. Путем включения адаптеров для высокопроизводительного секвенирования в праймеры для ПЦР продукты ПЦР можно секвенировать с массовым параллельным секвенированием. Альтернативно и трудоемко, продукт ПЦР можно клонировать и секвенировать. Методы вложенной ПЦР можно использовать для улучшения продукта для секвенирования .

Все последующие методы анализа метилирования ДНК с использованием ДНК, обработанной бисульфитом, основаны на этом отчете Frommer et al. (Фигура 2). [6] Хотя большинство других методов не являются методами, основанными на истинном секвенировании, термин «бисульфитное секвенирование» часто используется для описания методов анализа метилирования ДНК с превращением бисульфита в целом.

Пиросеквенирование [ править ]

Пиросеквенирование также использовалось для анализа ДНК, обработанной бисульфитом, без использования ПЦР, специфичной для метилирования. [7] [8] После ПЦР-амплификации интересующей области пиросеквенирование используется для определения бисульфит-преобразованной последовательности конкретных сайтов CpG в этой области. Отношение C-к-T в отдельных сайтах можно определить количественно на основании количества включенных C и T во время удлинения последовательности. Основное ограничение этого метода - стоимость технологии. Однако пиросеквенирование позволяет расширить его до высокопроизводительных методов скрининга .

Дальнейшее усовершенствование этого метода было недавно описано Wong et al., В котором используются аллель-специфические праймеры, которые включают однонуклеотидные полиморфизмы в последовательность праймера для секвенирования, что позволяет проводить раздельный анализ материнских и отцовских аллелей . [9] Этот метод особенно полезен для анализа геномного импринтинга .

Чувствительный к метилированию однонитевой конформационный анализ (MS-SSCA) [ править ]

Этот метод основан на методе анализа однонитевого конформационного полиморфизма (SSCA), разработанном для анализа однонуклеотидного полиморфизма (SNP). [10] SSCA различает одноцепочечные фрагменты ДНК идентичного размера, но с различной последовательностью на основе дифференциальной миграции при неденатурирующем электрофорезе . В MS-SSCA это используется для различения обработанных бисульфитом, амплифицированных с помощью ПЦР участков, содержащих интересующие сайты CpG. Хотя SSCA не обладает чувствительностью, когда только один нуклеотидразница присутствует, обработка бисульфитом часто приводит к ряду превращений C-to-T в большинстве областей интереса, и результирующая чувствительность приближается к 100%. MS-SSCA также обеспечивает полуколичественный анализ степени метилирования ДНК на основе соотношения интенсивностей полос. Однако этот метод предназначен для оценки всех сайтов CpG в целом в интересующей области, а не отдельных сайтов метилирования.

Анализ плавления с высоким разрешением (HRM) [ править ]

Еще один метод дифференциации преобразованной ДНК от неконвертированной обработанной бисульфитом ДНК - это использование анализа плавления с высоким разрешением (HRM), основанного на количественной ПЦР метода, первоначально разработанного для различения SNP. [11] ПЦР- ампликоны анализируются непосредственно путем изменения температуры и в результате высвобождения интеркалирующего флуоресцентного красителя во время плавления. Степень метилирования, представленная содержанием C-to-T в ампликоне , определяет скорость таяния и последующего высвобождения красителя. Этот метод позволяет проводить прямой количественный анализ в одной пробирке, но оценивает метилирование в амплифицированной области в целом, а не в конкретных сайтах CpG .

Расширение однонуклеотидного праймера, чувствительного к метилированию (MS-SnuPE) [ править ]

MS-SnuPE использует метод удлинения праймера, изначально разработанный для анализа однонуклеотидных полиморфизмов . [12] ДНК превращается в бисульфит, и специфичные для бисульфита праймеры отжигаются с последовательностью до пары оснований непосредственно перед представляющим интерес CpG. Праймеру позволяют расширить одну пару оснований в C (или T) с использованием дидезоксинуклеотидов , завершающих ДНК-полимеразу , и количественно определяют отношение C к T.

Для определения этого отношения C: T можно использовать ряд методов. Вначале MS-SnuPE полагался на радиоактивные ddNTP в качестве репортера удлинения праймера. Также можно использовать методы, основанные на флуоресценции или пиросеквенирование . [13] Тем не менее, масс-спектрометрический анализ с лазерной десорбционной ионизацией / временем пролета ( MALDI-TOF ) с использованием матрицы для различения двух продуктов удлинения полиморфных праймеров может быть использован, по сути, на основе анализа GOOD, разработанного для генотипирования SNP. . Ионно-парная обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (IP-RP- HPLC ) также использовалась для различения продуктов удлинения праймеров. [14]

Основание-специфическое расщепление / MALDI-TOF [ править ]

Недавно описанный метод Ehrich et al. дополнительно использует преимущества бисульфитных превращений, добавляя стадию специфичного для основания расщепления для усиления информации, полученной в результате нуклеотидных изменений. [15] При первом использовании in vitro транскрипции интересующей области в РНК (путем добавления сайта промотора РНК-полимеразы к праймеру ПЦР в начальной амплификации), РНКаза А может быть использована для расщепления РНК- транскрипта в сайтах, специфичных для оснований. Поскольку РНКаза А специфически расщепляет РНК по цитозиновым и урациловым рибонуклеотидам , специфичность к основанию достигается за счет добавления устойчивых к расщеплению dTTP, когда желательно цитозин-специфическое (C-специфическое) расщепление, и включение dCTP, когда желательно урацил-специфическое (U-специфическое) расщепление. Затем расщепленные фрагменты можно проанализировать с помощью MALDI-TOF . Обработка бисульфитом приводит либо к введению / удалению сайтов расщепления за счет преобразований C-to-U, либо к сдвигу массы фрагментов за счет преобразований G-в-A в амплифицированной обратной цепи. C-специфическое расщепление будет специфично разрезаться по всем метилированным сайтам CpG . Анализируя размеры полученных фрагментов, можно определить конкретный паттерн метилирования ДНК сайтов CpG внутри области, а не определять степень метилирования области в целом. Этот метод продемонстрировал эффективность для высокопроизводительного скрининга., позволяя исследовать многочисленные сайты CpG в нескольких тканях экономичным способом.

ПЦР, специфичная для метилирования (MSP) [ править ]

Рисунок 4: ПЦР, специфичная для метилирования, представляет собой чувствительный метод для избирательной амплификации и обнаружения интересующей метилированной области с использованием специфичных для метилирования праймеров на геномной ДНК, преобразованной бисульфитом. Такие праймеры будут отжигаться только с метилированными последовательностями и, таким образом, содержащими 5-метилцитозины , устойчивые к превращению бисульфитом. Альтернативно можно использовать неметилированные специфические праймеры.

В этом альтернативном методе анализа метилирования также используется ДНК, обработанная бисульфитом, но исключается необходимость секвенирования интересующей области. [16] Вместо этого пары праймеров сконструированы так, чтобы быть «метилированно-специфичными» путем включения последовательностей, дополняющих только непревращенные 5-метилцитозины , или, наоборот, «неметилированных специфичных», комплементарных тиминов, превращенных из неметилированных цитозинов. Метилирование определяется способностью конкретного праймера достигать амплификации. Этот метод особенно полезен для исследования островков CpG.с возможно высокой плотностью метилирования, поскольку увеличенное количество пар CpG в праймере увеличивает специфичность анализа. Размещение пары CpG на 3'-конце праймера также улучшает чувствительность. Первоначальный отчет с использованием MSP описал достаточную чувствительность для обнаружения метилирования 0,1% аллелей . В целом, MSP и связанные с ним протоколы считаются наиболее чувствительными при опросе статуса метилирования в конкретном локусе .

Метод MethyLight основан на MSP, но обеспечивает количественный анализ с помощью количественной ПЦР . [17] Используются метилированные специфические праймеры, а также метилированный репортерный зонд флуоресценции, который отжигается с амплифицированной областью. Альтернативно, праймеры или зонд могут быть сконструированы без специфичности метилирования, если требуется различение между парами CpG в задействованных последовательностях. Количественное определение проводится для метилированной эталонной ДНК. Модификация этого протокола для повышения специфичности ПЦР для успешно преобразованной бисульфитом ДНК (ConLight-MSP) использует дополнительный зонд для бисульфит-неконвертированной ДНК для количественной оценки этой неспецифической амплификации. [18]

Дальнейшая методология с использованием MSP-амплифицированной ДНК анализирует продукты с использованием анализа кривой плавления (Mc-MSP). [19] Этот метод амплифицирует ДНК, преобразованную бисульфитом, с праймерами, специфичными как для метилированных, так и для неметилированных соединений, и определяет количественное соотношение двух продуктов путем сравнения дифференциальных пиков, полученных при анализе кривой плавления. Был введен метод анализа плавления с высоким разрешением, который использует как количественную ПЦР, так и анализ плавления, в частности, для чувствительного обнаружения метилирования низкого уровня [20]

Методы на основе микрочипов [ править ]

Методы, основанные на микроматрицах, являются логическим продолжением технологий, доступных для анализа ДНК, обработанной бисульфитом, для проведения анализа метилирования в масштабах всего генома. [21] Олигонуклеотидные микроматрицы конструируют с использованием пар олигонуклеотидных гибридизационных зондов, нацеленных на интересующие сайты CpG . Один комплементарен неизмененной метилированной последовательности, а другой комплементарен неметилированной последовательности, преобразованной из C в U. Зонды также являются бисульфит-специфичными для предотвращения связывания с ДНК, не полностью преобразованной бисульфитом. Анализ метилирования Illumina - это один из таких анализов, который применяет технологию бисульфитного секвенирования на уровне микрочипов для получения данных о метилировании всего генома.

Ограничения [ править ]

5-гидроксиметилцитозин [ править ]

Бисульфитное секвенирование широко используется в геномах млекопитающих, однако сложности возникли с открытием новой модификации ДНК млекопитающих 5-гидроксиметилцитозина . [22] [23] 5-гидроксиметилцитозин превращается в цитозин-5-метилсульфонат при обработке бисульфитом, который затем читается как C при секвенировании. [24] Таким образом, бисульфитное секвенирование не позволяет различить 5-метилцитозин и 5-гидроксиметилцитозин. Это означает, что результат бисульфитного секвенирования больше нельзя определять только как метилирование ДНК, поскольку он представляет собой смесь 5-метилцитозина и 5-гидроксиметилцитозина. Разработка Tet-ассистированного оксидативного бисульфитного секвенирования Чуан Хэв Чикагском университете теперь могут различать две модификации при разрешении единой базы. [25]

Неполное преобразование [ править ]

Бисульфитное секвенирование основано на превращении каждого неметилированного остатка цитозина в урацил. Если преобразование неполное, последующий анализ будет неправильно интерпретировать непревращенные неметилированные цитозины как метилированные цитозины, что приведет к ложноположительным результатам для метилирования. Только цитозины в одноцепочечной ДНК восприимчивы к атаке бисульфитом, поэтому денатурация анализируемой ДНК имеет решающее значение. [2] Важно убедиться, что параметры реакции, такие как температура и концентрация соли, подходят для поддержания ДНК в одноцепочечной конформации и позволяют проводить полное преобразование. Встраивание ДНК в агарозуСообщалось, что гель улучшает скорость превращения, сохраняя нити ДНК физически разделенными. [26]

Разрушение ДНК во время обработки бисульфитом [ править ]

Основной проблемой при секвенировании бисульфитов является деградация ДНК, которая происходит одновременно с превращением. Условия, необходимые для полной конверсии, такие как длительное время инкубации, повышенная температура и высокая концентрация бисульфита, могут привести к деградации примерно 90% инкубированной ДНК. [27] Учитывая, что исходное количество ДНК часто ограничено, такая обширная деградация может быть проблематичной. Разложение происходит в виде депуринизации, приводящей к случайным разрывам цепей . [28] Следовательно, чем длиннее желаемый ампликон для ПЦР , тем более ограниченным, вероятно, будет количество интактных молекул шаблона. Это может привести к сбою амплификации ПЦР или потере количественно точной информации об уровнях метилирования в результате ограниченного отбора образцов молекул-матриц. Таким образом, важно оценить степень деградации ДНК в результате используемых условий реакции и рассмотреть, как это повлияет на желаемый ампликон . Также можно использовать методы для минимизации деградации ДНК, такие как циклическое изменение температуры инкубации. [28]

Другие проблемы [ править ]

Потенциально серьезная проблема следующей бисульфита лечения является неполным десульфонированию из пиримидиновых остатков из - за недостаточное подщелачивание раствора. Это может ингибировать некоторые ДНК-полимеразы , затрудняя последующую ПЦР. Однако этой ситуации можно избежать, отслеживая pH раствора, чтобы убедиться, что десульфирование будет полным. [2]

И последнее беспокойство вызывает то, что обработка бисульфитом значительно снижает уровень сложности образца, что может быть проблематичным, если необходимо провести несколько реакций ПЦР (2006). [5] Создание праймеров сложнее, и неуместная перекрестная гибридизация более часта.

Приложения: анализ метилирования по всему геному [ править ]

Достижения в области бисульфитного секвенирования привели к возможности их применения в масштабе всего генома , где ранее глобальное измерение метилирования ДНК было возможно только с использованием других методов, таких как геномное сканирование по ориентирам рестрикции . Картирование эпигенома человека рассматривается многими учеными как логическое продолжение проекта «Геном человека» . [29] [30] Эта эпигеномная информация будет важна для понимания того, как функция генетической последовательности реализуется и регулируется. Поскольку эпигеном менее стабилен, чем геном, считается, что он играет важную роль во взаимодействиях между геном и окружающей средой . [31]

Однако эпигеномное картирование по своей природе более сложно, чем секвенирование генома , поскольку эпигеном гораздо более изменчив, чем геном . Эпигеном человека меняется с возрастом, различается между тканями, изменяется под воздействием факторов окружающей среды и проявляет аберрации при заболеваниях. Однако такое обширное эпигеномное картирование, представляющее разные возрасты, типы тканей и болезненные состояния, дало бы ценную информацию о нормальном функционировании эпигенетических меток, а также о механизмах, ведущих к старению и болезням.

Прямые преимущества эпигеномного картирования включают вероятные достижения в технологии клонирования . Считается, что неспособность произвести клонированных животных с нормальной жизнеспособностью и продолжительностью жизни является результатом несоответствующих паттернов эпигенетических меток. Кроме того, паттерны аберрантного метилирования хорошо известны при многих формах рака . Глобальное гипометилирование приводит к снижению стабильности генома, в то время как локальное гиперметилирование промоторов генов-супрессоров опухолей часто объясняет их потерю функции . Конкретные паттерны метилирования указывают на конкретные типы рака, имеют прогностическое значение и могут помочь выбрать лучший курс лечения. [30]

Во всем мире предпринимаются широкомасштабные усилия по картированию эпигенома, которые были организованы в рамках проекта «Эпигеном человека» . [31] Это основано на многоуровневой стратегии, при которой бисульфитное секвенирование используется для получения профилей метилирования с высоким разрешением для ограниченного числа эталонных эпигеномов, в то время как менее тщательный анализ выполняется на более широком спектре образцов. Этот подход предназначен для максимизации понимания, полученного из заданного количества ресурсов, поскольку картирование всего генома с высоким разрешением остается дорогостоящим мероприятием.

Было показано, что анализ генов (например, с использованием таких инструментов, как DAVID и GoSeq) сильно смещен при применении к данным метилирования с высокой пропускной способностью (например, бисульфитное секвенирование по всему геному); Было высказано предположение, что это можно исправить, используя перестановки меток в образцах или используя статистическую модель для контроля различий в количестве зондов CpG / сайтов CpG, нацеленных на каждый ген. [32]

Окислительное бисульфитное секвенирование [ править ]

И 5-метилцитозин, и 5-гидроксиметилцитозин читаются как C при бисульфитном секвенировании. [24] Окислительное бисульфитное секвенирование - это метод различения 5-метилцитозина и 5-гидроксиметилцитозина при разрешении одного основания. В этом методе используется специфическое (с помощью Tet) химическое окисление 5-гидроксиметилцитозина до 5-формилцитозина, который впоследствии превращается в урацил во время обработки бисульфитом. [33] Единственное основание, которое затем читается как C, - это 5 ‑ метилцитозин, что дает карту истинного статуса метилирования в образце ДНК. Уровни 5 ‑ гидроксиметилцитозина также можно определить количественно, измерив разницу между бисульфитным и окислительным бисульфитным секвенированием.

См. Также [ править ]

  • Бисульфитное секвенирование с пониженной репрезентативностью

Ссылки [ править ]

  1. ^ Чаттерджи А., Стоквелл П.А., Роджер Э.Дж. и Морисон И.М. 2012. Сравнение программного обеспечения для выравнивания данных по бисульфитным последовательностям всего генома. Исследование нуклеиновых кислот 40 (10): e79.
  2. ^ a b c Fraga MF, Esteller M (сентябрь 2002 г.). «Метилирование ДНК: профиль методов и приложений» . Биотехнологии . 33 (3): 632, 634, 636–49. DOI : 10.2144 / 02333rv01 . PMID  12238773 .
  3. ^ El-Maarri O (2003). «Методы: метилирование ДНК». Пероксисомальные расстройства и регуляция генов . Успехи экспериментальной медицины и биологии. 544 . С. 197–204. DOI : 10.1007 / 978-1-4419-9072-3_23 . ISBN 978-0-306-48174-1. PMID  14713229 .
  4. ↑ Laird PW (апрель 2003 г.). «Сила и перспективы маркеров метилирования ДНК». Обзоры природы. Рак . 3 (4): 253–66. DOI : 10.1038 / nrc1045 . PMID 12671664 . S2CID 19574628 .  
  5. ^ a b Каллинан П.А., Файнберг А.П. (апрель 2006 г.). «Зарождающаяся наука эпигеномика» . Молекулярная генетика человека . 15 ТУ № 1 (90001): Р95-101. DOI : 10,1093 / HMG / ddl095 . PMID 16651376 . 
  6. ^ a b Фроммер М., Макдональд Л. Е., Миллар Д. С., Коллис С. М., Ватт Ф, Григ Г. В. и др. (Март 1992 г.). «Протокол геномного секвенирования, который дает положительное отображение остатков 5-метилцитозина в отдельных цепях ДНК» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 89 (5): 1827–31. Bibcode : 1992PNAS ... 89.1827F . DOI : 10.1073 / pnas.89.5.1827 . PMC 48546 . PMID 1542678 .  
  7. ^ Колелла S, Шен л, Baggerly К.А., Исса ДП, Krahe R (июль 2003 г.). «Чувствительный и количественный универсальный пиросеквенирующий анализ метилирования сайтов CpG» . Биотехнологии . 35 (1): 146–50. DOI : 10.2144 / 03351md01 . PMID 12866414 . 
  8. ^ Тост J, J Дункер, Gut IG (июль 2003). «Анализ и количественное определение различных положений метилирования в CpG-островках с помощью пиросеквенирования» . Биотехнологии . 35 (1): 152–6. DOI : 10.2144 / 03351md02 . PMID 12866415 . 
  9. ↑ Wong HL, Byun HM, Kwan JM, Campan M, Ingles SA, Laird PW, Yang AS (декабрь 2006 г.). «Быстрый и количественный метод анализа аллель-специфического метилирования ДНК» . Биотехнологии . 41 (6): 734–9. DOI : 10.2144 / 000112305 . PMID 17191619 . [ постоянная мертвая ссылка ]
  10. Перейти ↑ Bianco T, Hussey D, Dobrovic A (1999). «Чувствительный к метилированию однонитевой конформационный анализ (MS-SSCA): быстрый метод скрининга и анализа метилирования». Мутация человека . 14 (4): 289–93. DOI : 10.1002 / (SICI) 1098-1004 (199910) 14: 4 <289 :: AID-HUMU3> 3.0.CO; 2-A . PMID 10502775 . 
  11. ^ Wojdacz Т.К., Dobrovic A (2007). «Чувствительное к метилированию плавление с высоким разрешением (MS-HRM): новый подход к чувствительной и высокопроизводительной оценке метилирования» . Исследования нуклеиновых кислот . 35 (6): e41. DOI : 10.1093 / NAR / gkm013 . PMC 1874596 . PMID 17289753 .  
  12. ^ Gonzalgo ML, Jones PA (июнь 1997). «Быстрое количественное определение различий в метилировании в конкретных сайтах с использованием чувствительного к метилированию однонуклеотидного праймера (Ms-SNuPE)» . Исследования нуклеиновых кислот . 25 (12): 2529–31. DOI : 10.1093 / NAR / 25.12.2529 . PMC 146734 . PMID 9171109 .  
  13. ^ Ульман K, Бринкман A, Toliat MR, Ritter H, Nürnberg P (декабрь 2002). «Оценка потенциального эпигенетического биомаркера с помощью количественного анализа метил-однонуклеотидного полиморфизма». Электрофорез . 23 (24): 4072–9. DOI : 10.1002 / elps.200290023 . PMID 12481262 . S2CID 43737807 .  
  14. ↑ Matin MM, Baumer A, Hornby DP (октябрь 2002 г.). «Аналитический метод обнаружения различий в метилировании в конкретных хромосомных локусах с использованием удлинения праймера и ВЭЖХ с обращенной фазой ионной пары». Мутация человека . 20 (4): 305–11. DOI : 10.1002 / humu.10118 . PMID 12325026 . 
  15. ^ Эрих М., Нельсон М.Р., Станссенс П., Забо М., Лилоглу Т., Ксинарианос Г. и др. (Ноябрь 2005 г.). «Количественный высокопроизводительный анализ паттернов метилирования ДНК с помощью основно-специфического расщепления и масс-спектрометрии» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 102 (44): 15785–90. Bibcode : 2005PNAS..10215785E . DOI : 10.1073 / pnas.0507816102 . PMC 1276092 . PMID 16243968 .  
  16. ^ Herman JG , Graff JR, Myöhänen S, Нелькин BD, Baylin SB (сентябрь 1996). «Метилирование-специфическая ПЦР: новый ПЦР-анализ статуса метилирования CpG-островков» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 93 (18): 9821–6. Bibcode : 1996PNAS ... 93.9821H . DOI : 10.1073 / pnas.93.18.9821 . PMC 38513 . PMID 8790415 .  
  17. ^ Идз СА, Danenberg КД, Каваками К, Зальц Л.Б., Блейк С, D Шибата и др. (Апрель 2000 г.). «MethyLight: высокопроизводительный тест для измерения метилирования ДНК» . Исследования нуклеиновых кислот . 28 (8): 32e – 0. DOI : 10.1093 / NAR / 28.8.e32 . PMC 102836 . PMID 10734209 .  
  18. Перейти ↑ Rand K, Qu W, Ho T, Clark SJ , Molloy P (июнь 2002). «Конверсионно-специфическое обнаружение метилирования ДНК с использованием полимеразной цепной реакции в реальном времени (ConLight-MSP), чтобы избежать ложных срабатываний». Методы . 27 (2): 114–20. DOI : 10.1016 / S1046-2023 (02) 00062-2 . PMID 12095268 . 
  19. ^ Akey DT, Akey JM, Чжан K, L Jin (октябрь 2002). «Анализ метилирования ДНК на основе подходов с высокой пропускной способностью кривой плавления». Геномика . 80 (4): 376–84. DOI : 10.1006 / geno.2002.6851 . PMID 12376091 . 
  20. ^ Кристенсен LS, Mikeska T, Krypuy M, Dobrovic A (апрель 2008). «Чувствительный анализ плавления после специфической ПЦР для метилирования в реальном времени (SMART-MSP): высокопроизводительное количественное определение метилирования ДНК без зондов» . Исследования нуклеиновых кислот . 36 (7): e42. DOI : 10.1093 / NAR / gkn113 . PMC 2367707 . PMID 18344521 .  
  21. ^ Адорьян П., Дистлер Дж, Липшер Э, Модель F, Мюллер Дж, Пелет С и др. (Март 2002 г.). «Предсказание и обнаружение класса опухоли с помощью анализа метилирования ДНК на основе микрочипов» . Исследования нуклеиновых кислот . 30 (5): 21e – 21. DOI : 10.1093 / NAR / 30.5.e21 . PMC 101257 . PMID 11861926 .  
  22. ^ Tahiliani M, Koh KP, Shen Y, пастор WA, Bandukwala H, BrudnoY и др. Превращение 5-метилцитозина в 5-гидроксиметилцитозин в ДНК млекопитающих партнером MLL TET1 . Наука . 2009; 324 (5929): 930-5.
  23. ^ Kriaucionis S, Heintz N. Основание ядерной ДНК 5-гидроксиметилцитозин присутствует в нейронах Пуркинье и головном мозге. Наука, 2009; 324 (5929): 929-30.
  24. ^ а б Хуанг Y, пастор WA, Шен Y, Тахилиани М., Лю Д.Р., Рао А. Поведение 5-гидроксиметилцитозина в бисульфитном секвенировании. PLOS ONE, 2010; 5 (1): e8888 .
  25. ^ Yu, M., Hon, GC, Szulwach, KE, Song, C., Jin, P., Ren, B., He, C. Тет-ассистированное бисульфитное секвенирование 5-гидроксиметилцитозина. Nat. Протоколы 2012 , 7 , 2159.
  26. ^ Олек А, Освальда Дж, Вальтер J (декабрь 1996). «Модифицированный и улучшенный метод анализа метилирования цитозина на основе бисульфита» . Исследования нуклеиновых кислот . 24 (24): 5064–6. DOI : 10.1093 / NAR / 24.24.5064 . PMC 146326 . PMID 9016686 .  
  27. ^ Grunau C, Кларк SJ, Rosenthal A (июль 2001). «Бисульфитное геномное секвенирование: систематическое исследование критических экспериментальных параметров» . Исследования нуклеиновых кислот . 29 (13): E65-5. DOI : 10.1093 / NAR / 29.13.e65 . PMC 55789 . PMID 11433041 .  
  28. ^ а б Эрих М., Цолл С., Сюр С., Ван ден Бум Д. (2007). «Новый метод точной оценки качества ДНК после обработки бисульфитом» . Исследования нуклеиновых кислот . 35 (5): e29. DOI : 10.1093 / NAR / gkl1134 . PMC 1865059 . PMID 17259213 .  
  29. ^ Esteller M (июнь 2006). «Необходимость проекта эпигенома человека» . Канцерогенез . 27 (6): 1121–5. DOI : 10.1093 / carcin / bgl033 . PMID 16699174 . 
  30. ^ a b Брэдбери J (декабрь 2003 г.). «Проект эпигенома человека - запущен» . PLOS Биология . 1 (3): E82. DOI : 10.1371 / journal.pbio.0000082 . PMC 300691 . PMID 14691553 .  
  31. ^ a b Джонс PA, Martienssen R (декабрь 2005 г.). «План проекта человеческого эпигенома: семинар по человеческому эпигеному AACR» . Исследования рака . 65 (24): 11241–6. DOI : 10.1158 / 0008-5472.CAN-05-3865 . PMID 16357125 . 
  32. ^ Geeleher P, Хартнетт L, Egan LJ, Golden A, Раджа Али RA, Seoighe C (август 2013). «Анализ генома сильно искажен, когда применяется к данным метилирования всего генома» . Биоинформатика . 29 (15): 1851–7. DOI : 10.1093 / биоинформатики / btt311 . PMID 23732277 . 
  33. ^ Бут MJ, Бранко М.Р., Фиц G, Оксли Д., Крюгер Ф., Рейк В. и др. количественное секвенирование 5-метилцитозина и 5-гидроксиметилцитозина при разрешении одного основания. Наука. 2012; 336 (6083): 934-7 .

Внешние ссылки [ править ]

  • Протокол преобразования бисульфита
  • Проект эпигенома человека (HEP) - данные - Институт Сэнгера
  • Сеть передового опыта эпигеномов