Флуоресцентная гибридизация in situ
Флуоресцентная гибридизация in situ ( FISH ) представляет собой метод молекулярной цитогенетики , в котором используются флуоресцентные зонды , связывающиеся только с определенными частями последовательности нуклеиновой кислоты с высокой степенью комплементарности последовательностей . Он был разработан биомедицинскими исследователями в начале 1980-х [1] для обнаружения и локализации наличия или отсутствия определенных последовательностей ДНК на хромосомах . Флуоресцентную микроскопию можно использовать, чтобы выяснить, где флуоресцентный зонд связан с хромосомами. FISH часто используется для поиска специфических особенностей ДНК для использования вгенетическое консультирование , медицина и идентификация видов. [2] FISH также можно использовать для обнаружения и локализации специфических РНК-мишеней ( мРНК , днРНК и микроРНК ) [ нужна ссылка ] в клетках, циркулирующих опухолевых клетках и образцах тканей. В этом контексте он может помочь определить пространственно-временные паттерны экспрессии генов в клетках и тканях.
В биологии зонд представляет собой одну цепь ДНК или РНК, комплементарную интересующей последовательности нуклеотидов.
РНК-зонды могут быть разработаны для любого гена или любой последовательности внутри гена для визуализации мРНК , [3] [4] [5] , днРНК [6] [7] [8] и микроРНК в тканях и клетках. FISH используется для изучения цикла клеточного размножения, в частности интерфазы ядер, на наличие хромосомных аномалий. [9] FISH позволяет при анализе большой серии архивных случаев значительно облегчить идентификацию выделенной хромосомы за счет создания зонда с искусственной хромосомной основой, которая будет притягивать сходные хромосомы. [9] Сигналы гибридизации для каждого зонда при обнаружении нуклеиновой аномалии. [9]Каждый зонд для обнаружения мРНК и днРНК состоит из ~20-50 пар олигонуклеотидов, каждая пара занимает пространство в 40-50 п.н. Особенности зависят от конкретного используемого метода FISH. Для обнаружения микроРНК зонды используют запатентованную химию для специфического обнаружения микроРНК и охватывают всю последовательность микроРНК.
Зонды часто получают из фрагментов ДНК, которые были выделены, очищены и амплифицированы для использования в проекте «Геном человека» . Размер человеческого генома настолько велик по сравнению с длиной, которую можно было секвенировать напрямую, что пришлось разделить геном на фрагменты. (В конечном итоге эти фрагменты были приведены в порядок путем расщепления копии каждого фрагмента на еще более мелкие фрагменты с использованием эндонуклеаз, специфичных для последовательности, с измерением размера каждого небольшого фрагмента с помощью эксклюзионной хроматографии ., и используя эту информацию, чтобы определить, где большие фрагменты перекрываются друг с другом.) Чтобы сохранить фрагменты с их отдельными последовательностями ДНК, фрагменты были добавлены в систему постоянно реплицирующихся популяций бактерий. Клональные популяции бактерий, каждая из которых содержит одну искусственную хромосому, хранятся в различных лабораториях по всему миру. Искусственные хромосомы ( ВАС ) можно выращивать, выделять и маркировать в любой лаборатории, имеющей библиотеку. Геномные библиотеки часто называют в честь учреждения, в котором они были разработаны. Примером может служить библиотека RPCI-11, названная в честь Комплексного онкологического центра Розуэлл-Парк (ранее известного как Институт рака Розуэлл-Парк) в Буффало, штат Нью-Йорк .. Эти фрагменты составляют порядка 100 тысяч пар оснований и являются основой для большинства зондов FISH.
Целью использования RNA FISH является обнаружение транскриптов мРНК-мишеней в клетках, срезах тканей или даже целых препаратах. [10] Этот процесс состоит из 3 основных процедур: подготовка ткани (предгибридизация), гибридизация и промывка (постгибридизация).
.jpg/440px-FISH_(Fluorescent_In_Situ_Hybridization).jpg)
.jpg){kind=link}