Клоногенный анализ представляет собой метод клеточной биологии для изучения эффективности конкретных агентов на выживаемость и пролиферацию клеток. Он часто используется в онкологических лабораториях для определения эффекта лекарств или излучения на пролиферирующие опухолевые клетки [1], а также для титрования частиц, убивающих клетки (CKP) в вирусных запасах. [2] Впервые он был разработан Т.Т. Паком и Филипом Маркусом в Университете Колорадо в 1955 году. [3]
Хотя этот метод может обеспечить точные результаты, анализ требует много времени для настройки и анализа и может предоставить данные только о опухолевых клетках, которые могут расти в культуре. Слово «клоногенные» относится к тому факту, что эти клетки являются клонами друг друга.
Процедура [ править ]
Эксперимент включает три основных этапа:
- Обработка применяется к образцу клеток.
- Клетки «помещают» в сосуд для культуры ткани и дают им расти.
- Полученные колонии фиксируют, окрашивают и подсчитывают.
По завершении эксперимента измеряется процент клеток, выживших после обработки. Графическое представление зависимости выживаемости от концентрации лекарственного средства или дозы ионизирующего излучения называется кривой выживаемости клеток . [4]
Для анализа частиц, убивающих клетки , выжившая фракция клеток используется для аппроксимации распределения Пуассона вирусных частиц среди клеток и, следовательно, для определения количества CKP, встречающихся в каждой клетке.
В эксперименте можно использовать любой тип клеток , но поскольку целью этих экспериментов в онкологических исследованиях является открытие более эффективных методов лечения рака, опухолевые клетки человека являются типичным выбором. Клетки происходят либо из подготовленных «клеточных линий», которые были хорошо изучены и общие характеристики которых известны, либо из биопсии опухоли у пациента. [5] Клетки помещают в чашки Петри или в чашки, содержащие несколько круглых «лунок». Определенное количество клеток засевают в зависимости от эксперимента; для экспериментов с облучением обычно наносят большее количество клеток с увеличением дозы облучения. Например, при дозе 0 или 1 грейрадиации, 500 клеток могут быть посеяны, но на 4 или 5 серых, 2500 может быть посеяно, так как очень большое количество клеток погибает на этом уровне радиации, и эффекты специфической обработки будут ненаблюдаемыми.
Подсчет колоний клеток обычно проводится под микроскопом и довольно утомителен. Недавно были разработаны машины, использующие алгоритмы для анализа изображений. [6] Они регистрируются либо сканером изображений, либо автоматическим микроскопом, который может полностью автоматизировать процесс подсчета. [7] Один из таких автоматов работает, принимая определенные типы клеточных пластин через прорезь (в отличие от проигрывателя компакт-дисков), делая фотографию и загружая ее в компьютер для немедленного анализа. Надежные подсчеты доступны в секундах.
Переменные [ править ]
Лечение обычно представляет собой лекарство , ионизирующее излучение или их комбинацию. [8] В некоторых текущих исследованиях изучается усиление эффектов лекарств при одновременном облучении - синергетический эффект - и в этой ситуации изучаются две группы: контрольная группа, которая не лечится лекарством; и лечебная группа, которая лечится препаратом. Облучены обе группы. Если наклон их кривых выживания значительно различается, тогда может быть очевиден потенцирующий эффект, и его можно будет изучить дополнительно. Поскольку многие опухолевые клетки не будут выращивать колонии в культуре, анализ пролиферации клеток, который, как сообщается, имеет удовлетворительную точность при измерении синергетических эффектов между ионизирующим излучением и лекарствами, может использоваться в качестве суррогата.[9]
Подробное обсуждение многообещающих исследований, проводимых с помощью этой техники, выходит за рамки этого текста, но некоторые исследования включают влияние экспрессии определенных генов или рецепторов на клетку, ответы различных типов клеток или синергетический эффект. эффекты нескольких препаратов.
См. Также [ править ]
Ссылки [ править ]
- ^ Хоффман, Роберт М. (1991). «Анализы чувствительности in vitro при раке: обзор, анализ и прогноз». Журнал клинического лабораторного анализа . 5 (2): 133–43. DOI : 10.1002 / jcla.1860050211 . PMID 2023059 .
- ^ Ngunjiri, JM; Секеллик, MJ; Маркус, ИП (2008). «Клоногенный анализ вирусов гриппа типа А выявляет неинфекционные частицы, убивающие клетки (индуцирующие апоптоз)» . Журнал вирусологии . 82 (6): 2673–80. DOI : 10,1128 / JVI.02221-07 . PMC 2258965 . PMID 18184709 .
- ^ Стенограмма интервью TWiV @ http://www.twiv.tv/TWiV197-082612.pdf
- ^ Франкен, Николаас AP; Родермонд, Ганс М; Стэп, Ян; Хавеман, Яап; Ван Бри, Крис (2006). «Клоногенный анализ клеток in vitro» . Протоколы природы . 1 (5): 2315–9. DOI : 10.1038 / nprot.2006.339 . PMID 17406473 .
- Перейти ↑ Hamburger, Anne W. (1987). «Клоногенный анализ опухоли человека как модельная система в клеточной биологии». Международный журнал клонирования клеток . 5 (2): 89–107. DOI : 10.1002 / stem.5530050202 .
- ↑ Ниязи, Максимилиан; Ниязи, Исмат; Белка, Клаус (2007). «Подсчет колоний клоногенных анализов с использованием денситометрического программного обеспечения» . Радиационная онкология . 2 : 4. DOI : 10,1186 / 1748-717X-2-4 . PMC 1770926 . PMID 17212832 .
- ^ Дале, Йостейн; Какар, Маниш; Steen, Harald B .; Калхус, Олав (2004). «Автоматический подсчет колоний клеток млекопитающих с помощью плоского сканера и обработки изображений». Цитометрия . 60А (2): 182–8. DOI : 10.1002 / cyto.a.20038 .
- ^ Карни, DN; Винклер, CF (1985). «Тесты химиотерапевтической чувствительности in vitro». Важные достижения в онкологии : 78–103. PMID 3916747 .
- ^ Лю, Q; Мэн, В (2015). «Адаптация платформы для скрининга лекарств для обнаружения ассоциаций молекулярно-направленных радиосенсибилизаторов с геномными биомаркерами» . Молекулярные исследования рака . 13 : 713–720. DOI : 10.1158 / 1541-7786.MCR-14-0570 . PMC 4410013 . PMID 25667133 .
