Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

Цитометрия по времени пролета , или CyTOF , представляет собой приложение массовой цитометрии, используемое для количественного определения меченых мишеней на поверхности и внутри отдельных клеток. CyTOF позволяет количественно определять несколько клеточных компонентов одновременно с использованием детектора ICP-MS .

CyTOF использует иммунную метку для количественного определения белков , углеводов или липидов в клетке. Мишени выбираются для ответа на конкретный исследовательский вопрос и помечаются антителами, меченными металлическими лантаноидами . Меченые клетки распыляют и смешивают с нагретым газом аргоном, чтобы высушить клетки, содержащие частицы. Смесь пробы с газом фокусируется и зажигается с помощью аргоновой плазменной горелки . Это разбивает клетки на отдельные атомы и создает ионное облако. Обильные ионы с малым весом, генерируемые из окружающего воздуха и биологических молекул, удаляются с помощью квадрупольного масс-анализатора . Оставшиеся тяжелые ионы из меток антител количественно определяют с помощьюВремяпролетная масс-спектрометрия . [1] Содержание ионов коррелирует с количеством мишени на клетку и может использоваться для определения качества клеток. [2]

Чувствительность масс-спектрометрии для обнаружения различных ионов позволяет измерять до 50 мишеней на ячейку, избегая проблем со спектральным перекрытием, наблюдаемым при использовании флуоресцентных зондов. [3] [4] Однако эта чувствительность также означает, что следы загрязнения тяжелыми металлами вызывают беспокойство. [5] Использование большого количества зондов создает новые проблемы при анализе генерируемых данных большой размерности. [6]

Рисунок 1: Основные этапы процедуры CyTOF. Изотопное хелатирование, мечение антител, окрашивание клеток и введение аэрозоля в аппарат ICP-MS, а также анализ данных.

История [ править ]

В 1994 году Цутому Номидзу и его коллеги из Университета Нагоя провели первые масс-спектрометрические эксперименты с отдельными клетками. Номидзу понял, что отдельные клетки можно распылять, сушить и зажигать в плазме, чтобы генерировать облака ионов, которые можно обнаружить с помощью эмиссионной спектрометрии. [7] В этом типе экспериментов можно было количественно определить такие элементы, как кальций внутри клетки. Вдохновленный проточной цитометрией, в 2007 году Скотт Д. Таннер на основе этого ИСП-МС разработал первый мультиплексный анализ с использованием металлов лантаноидов для маркировки ДНК и маркеров клеточной поверхности. [8] В 2008 году Таннер описал тандемное подключение проточного цитометра к аппарату ИСП-МС, а также новые метки антител, которые позволили бы проводить массовый мультиплексный анализ клеточных маркеров. [9]Путем дальнейшей оптимизации скорости обнаружения и чувствительности этого аппарата ИСП-МС с сопряженным потоком они построили первый аппарат CyTOF. [1]

Аппарат CyTOF изначально принадлежал канадской компании DVS Sciences, но теперь является эксклюзивным продуктом Fluidigm после их приобретения в 2014 году компании DVS Sciences. Было 3 итерации аппарата CyTOF, названных CyTOF, CyTOF2 и Helios ™. [5] Последовательные улучшения были в основном за счет увеличения дальности обнаружения и параметров программного обеспечения с помощью машины Helios, способной обнаруживать металлы от итция-89 до висмута-209, а также пропускной способности и анализа 2000 событий в минуту.

Рабочий процесс [ править ]

Лантанидов группа элементов используются для мечения антител , в качестве фона в биологических образцах является очень низким. [10] При выборе подходящего изотопа для биомаркера биомаркеры с низкой экспрессией должны сочетаться с изотопом с высокой интенсивностью сигнала. [11] Если необходимо использовать менее чистый изотоп, его следует сочетать с биомаркером с низкой экспрессией, чтобы свести к минимуму любое неспецифическое связывание или фон.

Изотопные полимеры построены с использованием диэтилентриаминпентауксусной кислоты (DTPA) хелатора для связывания ионов вместе. [11] Полимер оканчивается тиолом или малеимидом, который связывает его с восстановленными дисульфидами в Fc-области антитела. [12] Четыре-пять полимеров связаны с антителом, в результате чего на одно антитело приходится около 100 изотопных атомов. [12] Меченые антитела могут быть в растворе, конъюгированы с шариками или иммобилизованы на поверхности. Окрашивание клеток осуществляется по тем же процедурам, что и при флуоресцентном окрашивании для проточной цитометрии. [12]

Чтобы различать живые и мертвые клетки, клетки можно исследовать с помощью родия , интеркалятора, который может проникать только в мертвые клетки. Затем все клетки фиксируются и окрашиваются иридием , который проникает во все клетки, чтобы можно было визуализировать, какие из них живы. [12]

Метод введения клеток в массовый цитометр представляет собой инъекцию разделителя аэрозоля. [11] Затем клетки захватываются потоком газообразного аргона , затем транспортируются в плазму, где они испаряются, распыляются и ионизируются. Ячейка теперь представляет собой облако ионов, которое переходит в центр ионной оптики. Затем используется времяпролетный анализатор для измерения массы ионов.

Анализ данных [ править ]

Ионы ускоряются через спектрометр импульсами. Электронное облако, генерируемое одной ячейкой, обычно составляет 10–150 импульсов. Результатом прогона Helios ™ является файл двоичных интегрированных данных о массе (IMD), который содержит интенсивности электронов, измеренные по ионам для каждого массового канала. Непрерывные импульсы должны быть разделены на отдельные события ячейки, соответствующие ионному облаку, генерируемому одной ячейкой. Каждая ячейка из 10–150 импульсов, которая превышает установленный пользователем нижний порог свертки, рассматривается программным обеспечением Helios ™ как событие ячейки. [1] [5]Нижний порог свертки - это минимальное количество ионов, которое должно быть достигнуто по всем ионным каналам, чтобы считаться клеточным событием. Значение этого параметра увеличивается с количеством измеряемых ионов, и, таким образом, требуется больше подсчетов для определения события ячейки, когда используется больше меток. [5]  

Для анализа данных файл IMD конвертируется в стандартный формат проточной цитометрии (FCS). Этот файл содержит общее количество ионов для каждого канала для каждой клетки, расположенной в матрице, и представляет собой тот же файл, сгенерированный во время проточной цитометрии . [5] Ручное стробирование этих данных может быть выполнено, как это делается для проточной цитометрии, и большинство инструментов, доступных для анализа проточной цитометрии, были перенесены в CyTOF (см. Биоинформатику проточной цитометрии ). [6] Данные CyTOF обычно имеют большие размеры . Для определения взаимосвязей между уменьшением размерности популяций клеток.часто используются алгоритмы. Распространены несколько алгоритмов кластеризации многомерного анализа. Популярные инструменты включают tSNE , FlowSOM и псевдовремени диффузии (DPT). [6] Методы последующего анализа зависят от целей исследования.

Приложения [ править ]

CyTOF предоставляет важную информацию на уровне отдельной клетки об экспрессии белка, иммунофенотипе и функциональных характеристиках. Это ценный инструмент в иммунологии , где большое количество параметров помогло прояснить работу этой сложной системы. [13] [11] Например, естественные клетки-киллеры обладают различными свойствами, на которые влияют многочисленные маркеры в различных комбинациях, которые невозможно было легко проанализировать до появления этой технологии. [14] Одновременное измерение многих биомаркеров позволяет идентифицировать более 30 различных подмножеств иммунофенотипов в одной сложной группе клеток. [13] Это может помочь более полно охарактеризовать иммунную функцию, инфекционные заболевания и рак, а также понять реакцию клеток на терапию.

Преимущества и недостатки [ править ]

Основным преимуществом CYTOF является возможность исследовать большее количество параметров на панели, чем другие методы цитометрии. Это позволяет лучше понять сложные и разнородные клеточные популяции без необходимости использования множества сложных и перекрывающихся панелей. Панели могут включать до 45 антител, в отличие от 10, которые могут быть выполнены с помощью проточной цитометрии, но для их разработки требуется большой опыт. [13] Больше антител на панель экономит время, позволяет понять более широкую картину и требует меньшего количества клеток на эксперимент, что особенно выгодно, когда образцы ограничены, например, при исследованиях опухолей. [4]

Использование изотопов тяжелых металлов также снижает фон по сравнению с использованием флуоресцентных антител. Некоторые типы клеток, такие как миелоидные клетки, имеют высокую скорость автофлуоресценции, что создает большой фоновый шум при цитометрии. [4] Однако используемые редкие изотопы тяжелых металлов не присутствуют в биологических системах, поэтому фон практически отсутствует, а общая чувствительность повышается. [4]Перекрытие при обнаружении различных тяжелых металлов также очень низкое по сравнению с перекрытием, наблюдаемым при флуоресцентной цитометрии, что значительно упрощает создание панели из многих маркеров. Флуоресцентные красители подвержены фотообесцвечиванию, поэтому весь процесс должен происходить в течение нескольких часов после окрашивания. Однако антитела, меченные металлами, жизнеспособны до двух недель без потери сигнала, что делает эксперименты более гибкими. Окрашенные образцы также можно замораживать, что может быть особенно полезно для клинических испытаний, когда образцы собираются в течение более длительного периода времени. [4]

Стоимость CyTOF высока, так как антитела, меченные металлами, и наборы конъюнктивных антител дороги. Основным недостатком CyTOF является то, что скорость потока сбора данных довольно низкая по сравнению с проточной цитометрией почти на порядок. [11] [4] Поскольку тяжелые металлы часто встречаются в лабораторных реактивах, очень важно избегать загрязнения во время пробоподготовки.

Ссылки [ править ]

  1. ^ a b c Бандура Д.Р., Баранов В.И., Орнатский О.И., Антонов А., Кинах Р., Лу X и др. (Август 2009 г.). «Массовая цитометрия: метод многоцелевого иммуноанализа в режиме реального времени на основе времяпролетной масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой». Аналитическая химия . 81 (16): 6813–22. DOI : 10.1021 / ac901049w . PMID  19601617 .
  2. ^ Ван В, Су Б, Панг Л, Цяо Л, Фэн Й, Оуян И и др. (Июнь 2020 г.). «Высокомерное иммунное профилирование с помощью массовой цитометрии выявило иммуносупрессию и нарушение функции иммунитета у пациентов с COVID-19» . Клеточная и молекулярная иммунология . 17 (6): 650–652. DOI : 10.1038 / s41423-020-0447-2 . PMC 7186533 . PMID 32346099 .  
  3. ^ Spitzer MH, Нолан GP (май 2016). «Массовая цитометрия: отдельные клетки, многие особенности» . Cell . 165 (4): 780–91. DOI : 10.1016 / j.cell.2016.04.019 . PMC 4860251 . PMID 27153492 .  
  4. ^ Б с д е е Gadalla R, B, Noamani MacLeod BL, Dickson RJ, Го M, W, Xu и др. (2019). «Проверка CyTOF против проточной цитометрии для иммунологических исследований и мониторинга клинических испытаний рака человека» . Границы онкологии . 9 : 415. DOI : 10,3389 / fonc.2019.00415 . PMC 6534060 . PMID 31165047 .  
  5. ^ a b c d e Olsen LR, Leipold MD, Pedersen CB, Maecker HT (февраль 2019 г.). «Анатомия данных цитометрии единичной клеточной массы» . Цитометрия. Часть A . 95 (2): 156–172. DOI : 10.1002 / cyto.a.23621 . PMID 30277658 . 
  6. ^ a b c Palit S, Heuser C, de Almeida GP, Theis FJ, Zielinski CE (2019). «Решение проблем анализа данных с высокой размерностью отдельных клеток в иммунологии» . Границы иммунологии . 10 : 1515. DOI : 10.3389 / fimmu.2019.01515 . PMC 6634245 . PMID 31354705 .  
  7. ^ Номидзу Т, Kaneco S, Т Танака, Ито Д, Кавагути Н, Vallee БТ (1994-10-01). «Определение содержания кальция в индивидуальных биологических клетках с помощью атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивно связанной плазмой». Аналитическая химия . 66 (19): 3000–3004. DOI : 10.1021 / ac00091a004 .
  8. Перейти ↑ Tanner SD, Ornatsky O, Bandura DR, Baranov VI (март 2007 г.). «Мультиплексный биотест с масс-спектрометрией с индуктивно связанной плазмой: на пути к многомерной технологии с одной ячейкой». Spectrochimica Acta Часть B: Атомная спектроскопия . 62 (3): 188–195. DOI : 10.1016 / j.sab.2007.01.008 .
  9. Перейти ↑ Tanner SD, Bandura DR, Ornatsky O, Baranov VI, Nitz M, Winnik MA (2008-01-01). «Проточный цитометр с обнаружением масс-спектрометра для массового мультиплексного анализа одноклеточных биомаркеров». Чистая и прикладная химия . 80 (12): 2627–2641. DOI : 10,1351 / pac200880122627 .
  10. ^ Орнатский О.И., Кинах Р., Бандура Д.Р., Лу X, Таннер С.Д., Баранов В.И. и др. (2008-03-28). «Разработка аналитических методов мультиплексного биоанализа с масс-спектрометрией с индуктивно связанной плазмой» . Журнал аналитической атомной спектрометрии . 23 (4): 463–469. DOI : 10.1039 / B710510J . PMC 2600572 . PMID 19122859 .  
  11. ^ a b c d e Chattopadhyay PK, Roederer M (июль 2012 г.). «Цитометрия: сегодняшние технологии и завтрашние горизонты» . Методы . Проточная цитометрия и сортировка клеток: новое поколение. 57 (3): 251–8. DOI : 10.1016 / j.ymeth.2012.02.009 . PMC 3374038 . PMID 22391486 .  
  12. ^ a b c d Таннер С.Д., Баранов В.И., Орнатский О.И., Бандура Д.Р., Джордж TC (май 2013 г.). «Введение в массовую цитометрию: основы и приложения». Иммунология рака, иммунотерапия . 62 (5): 955–65. DOI : 10.1007 / s00262-013-1416-8 . PMID 23564178 . 
  13. ^ a b c Бьёрнсон З. Б., Нолан Г. П., Фантл В. Дж. (август 2013 г.). «Цитометрия единичных клеток для анализа функционального состояния иммунной системы» . Текущее мнение в иммунологии . Патогены-хозяева / Иммунное старение. 25 (4): 484–94. DOI : 10.1016 / j.coi.2013.07.004 . PMC 3835664 . PMID 23999316 .  
  14. ^ Leipold MD, Newell EW, Maecker HT (2015). Шоу AC (ред.). «Многопараметрическое фенотипирование PBMC человека с использованием масс-цитометрии» . Методы молекулярной биологии . Методы молекулярной биологии. Нью-Йорк, штат Нью-Йорк: Спрингер. 1343 : 81–95. DOI : 10.1007 / 978-1-4939-2963-4_7 . ISBN 978-1-4939-2963-4. PMC  4748856 . PMID  26420710 .