Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Иммуномечение - определение антигена в ткани с помощью меченых антиген-специфических антител

Иммуномечение - это биохимический процесс, который позволяет обнаруживать и локализовать антиген в определенном месте в клетке, ткани или органе. Антигены - это органические молекулы, обычно белки , способные связываться с антителами . Эти антигены можно визуализировать с помощью комбинации антиген-специфических антител, а также средства обнаружения, называемого меткой, которая ковалентно связана с антителом. [1] Если процесс иммуномечения предназначен для выявления информации о клетке или ее субструктурах, этот процесс называется иммуноцитохимией . [2] Иммуномечение более крупных структур называется иммуногистохимией . [3]

Производство антител для иммуномечения состоит из двух сложных этапов. Первый производит антитело, которое специфически связывается с интересующим антигеном, а второй - слияние метки с антителом. Поскольку нецелесообразно слить метку со всеми возможными антиген-специфическими антителами, в большинстве процессов иммуномечения используется непрямой метод обнаружения. Этот непрямой метод использует первичное антитело, которое является антиген-специфичным, и вторичное антитело, слитое с меткой, которая специфически связывает первичное антитело. Этот непрямой подход позволяет массовое производство вторичных антител, которые можно купить с полки. [4] В соответствии с этим непрямым методом в тест-систему добавляется первичное антитело. Первичное антитело ищет и связывается с антигеном-мишенью. Затем добавляется помеченное вторичное антитело, предназначенное для прикрепления исключительно к первичному антителу.

Типичные метки включают: флуоресцентное соединение, золотые шарики, конкретную метку эпитопа [5] или фермент, который продуцирует окрашенное соединение. Ассоциация меток с мишенью через антитела обеспечивает идентификацию и визуализацию интересующего антигена в его естественном местоположении в ткани, таком как клеточная мембрана , цитоплазма или ядерная мембрана . При определенных условиях метод может быть адаптирован для получения количественной информации. [4]

Иммуномечение можно использовать в фармакологии , молекулярной биологии , биохимии и любой другой области, где важно знать точное местоположение молекулы, связывающейся с антителами. [6] [7] [8]

Косвенный и прямой метод [ править ]

Есть два метода иммуномечения: прямой и непрямой. В прямом методе иммуномечения первичное антитело конъюгировано непосредственно с меткой. [9] Прямой метод полезен для минимизации перекрестной реакции , показателя неспецифичности, который присущ всем антителам и который умножается на каждое дополнительное антитело, используемое для обнаружения антигена. Однако прямой метод гораздо менее практичен, чем непрямой, и обычно не используется в лабораториях, поскольку первичные антитела должны быть ковалентно помечены, что требует большого количества очищенных антител. Кроме того, прямой метод потенциально гораздо менее чувствителен, чем косвенный метод. [10] Поскольку несколько вторичных антител способны связываться с разными частями или доменами одного первичного антитела, связывающего целевой антиген, с каждым антигеном связано больше меченых антител. Больше метки на антиген приводит к большему количеству сигнала на антиген. [11]

Для достижения высокой степени специфичности и чувствительности можно использовать различные непрямые методы. Во-первых, часто используются двухэтапные протоколы, чтобы избежать перекрестной реакции между иммуномечением нескольких смесей первичных и вторичных антител , где часто используются вторичные фрагменты антигенсвязывающих антител. Во-вторых, можно использовать гаптенилированные первичные антитела, где вторичное антитело может распознавать связанный гаптен . Гаптен ковалентно связан с первичным антителом по сукцинили imidesters или конъюгирует IgG Fc -специфических Fab секции. Наконец, первичные моноклональные антитела.которые имеют разные изотипы Ig, могут быть обнаружены специфическими вторичными антителами против интересующего изотипа . [10]

Связывание и специфичность антител [ править ]

В целом антитела должны связываться с антигенами с высокой специфичностью и аффинностью. [12] Специфичность связывания относится к способности антитела связывать и связывать только один антиген-мишень. Ученые обычно используют моноклональные антитела и поликлональные антитела , которые состоят из синтетических пептидов. Во время производства этих антител антигенспецифические антитела изолируются путем присоединения антигенного пептида к аффинной колонке и позволяя неспецифическим антителам просто проходить через колонку. Это снижает вероятность связывания антител с нежелательным эпитопом.антигена, не обнаруженного в исходном пептиде. Следовательно, специфичность антитела устанавливается путем специфической реакции с белком или пептидом, который используется для иммунизации с помощью определенных методов, таких как иммуноблоттинг или иммунопреципитация . [13]

При установлении специфичности антител ключевым фактором является тип используемых синтетических пептидов или очищенных белков. Чем меньше специфичность антитела, тем больше вероятность визуализации чего-либо, кроме антигена-мишени. В случае синтетических пептидов преимущество состоит в том, что аминокислотная последовательность легко доступна, но пептиды не всегда напоминают трехмерную структуру или посттрансляционную модификацию, обнаруженную в нативной форме белка. Следовательно, антитела, которые вырабатываются для работы против синтетического пептида, могут иметь проблемы с природным 3-D белком. Эти типы антител могут привести к плохим результатам в иммунопреципитации или иммуногистохимии.эксперименты, однако антитела могут быть способны связываться с денатурированной формой белка во время цикла иммуноблоттинга. Напротив, если антитело хорошо работает с очищенными белками в их нативной форме, а не денатурированными , иммуноблот не может использоваться в качестве стандартизованного теста для определения специфичности связывания антитела, особенно в иммуногистохимии. [14]

Специфические методы иммуномечения [ править ]

Иммуномечение для световой микроскопии [ править ]

Световая микроскопия - это использование светового микроскопа , который представляет собой инструмент, который требует использования света для просмотра увеличенного образца. Как правило, часто используется составной световой микроскоп, в котором две линзы, окуляр и объектив работают одновременно, обеспечивая увеличение образца. [15] В световой микроскопии часто используется иммунная метка для наблюдения за тканями или клетками-мишенями. Например, было проведено исследование для изучения морфологии и выработки гормонов в культурах клеток аденомы гипофиза с помощью световой микроскопии и других методов электронной микроскопии. Этот тип микроскопии подтвердил, что первичные культуры клеток аденомы сохраняют свои физиологические характеристики in vitro., что соответствует гистологическому исследованию. Кроме того, культуры клеток аденомы гипофиза человека просматривали с помощью световой микроскопии и иммуноцитохимии, где эти клетки фиксировали и иммуно метили моноклональным мышиным антителом против человеческого GH и поликлональным кроличьим антителом против PRL. Это пример того, как иммуномеченая клеточная культура клеток аденомы гипофиза, которую просматривали с помощью световой микроскопии и других методов электронной микроскопии, может помочь в правильной диагностике опухолей. [16]

Иммуномечение для электронной микроскопии [ править ]

Электронная микроскопия (ЭМ) - это сфокусированная область науки, в которой электронный микроскоп используется как инструмент для наблюдения за тканями. [17] Электронная микроскопия имеет увеличение до 2 миллионов раз, тогда как световая микроскопия имеет увеличение только до 1000-2000 раз. [18] Существует два типа электронных микроскопов: просвечивающий электронный микроскоп и сканирующий электронный микроскоп . [17]

Электронная микроскопия - это распространенный метод, использующий метод иммуномечения для просмотра меченых тканей или клеток. Метод электронного микроскопа следует многим из тех же концепций, что и иммуномечение для световой микроскопии, когда конкретное антитело способно распознавать местоположение интересующего антигена, а затем рассматриваться в электронном микроскопе. Преимущество электронной микроскопии перед световой микроскопией заключается в возможности просматривать целевые области на их субклеточном уровне. Обычно для ЭМ используется тяжелый металл с электронной плотностью, который может отражать падающие электроны. Иммуномечение обычно подтверждают с помощью светового микроскопа, чтобы убедиться в наличии антигена, а затем прослеживают с помощью электронного микроскопа. [19]

Иммуномечение и электронная микроскопия часто используются для просмотра хромосом . Было проведено исследование для просмотра возможных улучшений структур хромосом с иммунной меткой, таких как топоизомераза IIα и конденсин, в разрезанных митотических хромосомах. В частности, эти исследователи использовали УФ-облучение разделенных ядер или показали, как хромосомы помогают с помощью высоких уровней специфической иммунной метки, которые наблюдались с помощью электронной микроскопии. [20]

Иммуномечение для просвечивающей электронной микроскопии [ править ]

Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) использует просвечивающий электронный микроскоп для формирования двухмерного изображения путем выстрела электронов через тонкий кусок ткани. Чем ярче определенные области на изображении, тем больше электронов может пройти через образец. [17] Просвечивающая электронная микроскопия использовалась как способ просмотра иммуномеченых тканей и клеток. Например, бактерии можно увидеть с помощью ТЕА, когда применяется иммунная метка. Исследование было проведено с целью изучения структуры и CS6 CS3 фимбрии в различных палочки Escherichia штаммов, которые были обнаружены с помощью ПЭМ с последующим отрицательным окрашиванием и иммунноокрашивания. Более конкретно, иммуномечение фимбрий подтвердило существование различных поверхностных антигенов.[21]

Иммуномечение для сканирующей электронной микроскопии [ править ]

В растровой электронной микроскопии (SEM) используется сканирующий электронный микроскоп, который создает большие изображения, которые воспринимаются как трехмерные, хотя на самом деле это не так. Этот тип микроскопа концентрирует пучок электронов на очень небольшой площади (2-3 нм) образца, чтобы произвести электроны из указанного образца. Эти вторичные электроны обнаруживаются датчиком, и изображение образца создается в течение определенного периода времени. [17]

Сканирующая электронная микроскопия - часто используемый метод иммуномечения. СЭМ способен обнаруживать поверхность клеточных компонентов с высоким разрешением. Этот метод иммунофлуоресценции очень похож на метод иммунофлуоресценции, но вместо флуорофора используется метка из коллоидного золота. В целом концепции очень параллельны в том, что используется неконъюгированное первичное антитело, за которым последовательно следует помеченное вторичное антитело, которое работает против первичного антитела. [22] Иногда SEM в сочетании с иммуномаркированием золотых частиц вызывает затруднения в отношении разрешения частиц и зарядов под электронным лучом; тем не менее, это снижение разрешения было устранено за счет улучшения аппаратуры SEM с помощью формирования изображений с обратным рассеянием электронов. [23] Это связано с тем, что дифракционные картины обратного рассеяния электронов обеспечивают чистую поверхность образца для взаимодействия с первичным электронным пучком. [24]

Иммуномаркировка золотом (Immunogold Labeling) [ править ]

Иммуномечение золотыми частицами, также известное как окрашивание иммунным золотом , регулярно используется со сканирующей электронной микроскопией и просвечивающей электронной микроскопией для успешного определения области в клетках и тканях, где расположены антигены. [23] Методика мечения золотыми частицами была впервые опубликована Фолком, В. и Тейлором, Г., когда они смогли пометить частицы золота против гамма-глобулинов кролика против сальмонеллы за один шаг, чтобы определить местонахождение антигенов сальмонеллы. . [23] [25]

Исследования показали, что размер частицы золота должен быть увеличен (> 40 нм), чтобы рассматривать клетки при малом увеличении, но слишком большие частицы золота могут снизить эффективность связывания золотой метки. Ученые пришли к выводу, что использование более мелких частиц золота (1-5 нм) должно быть увеличено и усилено серебром. Хотя окрашивание четырехокиси осмия может поцарапать серебро, было обнаружено, что усиление частиц золота не чувствительно к царапинам при окрашивании четырехокиси осмия; Таким образом, во многих исследованиях клеточной адгезии различных субстратов можно использовать механизм мечения иммунозолотом через усиление частиц золота. [26]

Ссылки [ править ]

  1. Перейти ↑ Hyatt, AD, & Wise, TG (2001). «Иммуномечение». Иммуноцитохимия и гибридизация in situ в биомедицинских науках - Глава 5 - Иммуномечение . Бостон, Массачусетс: Birkhauser Boston. С. 73–107. DOI : 10.1007 / 978-1-4612-0139-7_5 . ISBN 978-1-46-12-0139-7.
  2. ^ Nanci А, Wazen R, Нисио С, Zalzal SF (2008). «Иммуноцитохимия матричных белков кальцифицированных тканей: функциональная биохимия в разделе» . Eur J Histochem . 52 (4): 201–14. DOI : 10.4081 / 1218 . PMID 19109094 . 
  3. ↑ Swanson PE (сентябрь 1988 г.). «Основы иммуногистохимии. Практический обзор» . Являюсь. J. Clin. Патол . 90 (3): 333–9. DOI : 10.1093 / ajcp / 90.3.333 . PMID 3046324 . 
  4. ^ a b Rapley R, Walker JM, ред. (2008). Справочник по молекулярным биометодам (2-е изд.). Тотова, Нью-Джерси: Humana Press. п. 1066. ISBN 978-1-60327-370-1.
  5. ^ Pang J, Цзэн X, Xiao RP, Lakatta EG, Lin L (июнь 2009). «Дизайн, создание и тестирование модулей экспрессии млекопитающих, которые маркируют мембранные белки» . Protein Sci . 18 (6): 1261–71. DOI : 10.1002 / pro.136 . PMC 2774436 . PMID 19472344 .  
  6. ^ Rangell LK, Келлер Г. А. (август 2000). «Применение микроволновой технологии для обработки и иммуномаркировки пластиковых и криосрезов» . Журнал гистохимии и цитохимии . 48 (8): 1153–9. DOI : 10.1177 / 002215540004800812 . PMID 10898808 . 
  7. ^ Malecki M, Hsu A, Чыонг L, Sanchez S (январь 2002). «Молекулярное иммуномечение антителами с рекомбинантными одноцепочечными вариабельными фрагментами (scFv), сконструированными с использованием металлсвязывающих доменов» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 99 (1): 213–8. Bibcode : 2002PNAS ... 99..213M . DOI : 10.1073 / pnas.261567298 . PMC 117541 . PMID 11756693 .  
  8. ^ Хэйкок JW (сентябрь 1989). «Количественное определение тирозингидроксилазы, уровни белка: точечное иммуномечение с аффинно-очищенным антителом». Аналитическая биохимия . 181 (2): 259–66. DOI : 10.1016 / 0003-2697 (89) 90240-6 . PMID 2573292 . 
  9. ^ Чендлер, Дуглас Э .; Роберсон, Роберт В. (2009). Биоимиджинг: современные концепции световой и электронной микроскопии . Садбери, Массачусетс: издательство "Джонс и Бартлетт". п. 311. ISBN. 978-0-7637-3874-7.
  10. ^ a b Buchwalow IB, Minin EA, Boecker W (2005). «Метод многоцветного флуоресцентного иммуноокрашивания для одновременного нацеливания на антигены». Acta Histochem . 107 (2): 143–8. DOI : 10.1016 / j.acthis.2005.01.003 . PMID 15950054 . 
  11. Перейти ↑ Ramos-Vara JA (июль 2005 г.). «Технические аспекты иммуногистохимии». Вет. Патол . 42 (4): 405–26. DOI : 10.1354 / vp.42-4-405 . PMID 16006601 . S2CID 6229029 .  
  12. ^ Кумагай I, Tsumoto K (2010-04-19). Связывание антиген-антитело . eLS . С. 1–7. DOI : 10.1002 / 9780470015902.a0001117.pub2 . ISBN 978-0470016176.
  13. ^ Burry RW (февраль 2000). «Контроль специфичности иммуноцитохимических методов» . J. Histochem. Cytochem . 48 (2): 163–6. DOI : 10.1177 / 002215540004800201 . PMID 10639482 . 
  14. ^ Bordeaux J, валлийский А, Агаруол S, Killiam Е, Бакеро М, Ханна Дж, Анагносту В, Rimm D (март 2010 г.). «Проверка антител» . Биотехнологии . 48 (3): 197–209. DOI : 10.2144 / 000113382 . PMC 3891910 . PMID 20359301 .  
  15. ^ Мерфи, Дуглас Б. Дэвидсон; Майкл В. (2013). Основы световой микроскопии и электронной визуализации (второе изд.). Хобокен, Нью-Джерси: John Wiley and Sons, Inc., стр. 1-2. ISBN 978-0-471-69214-0.
  16. ^ Фазекас я, Hegedüs В, Bácsy Е, и др. (2005). «Характеристика аденом гипофиза человека в клеточных культурах с помощью световой и электронной микроскопии морфологии и иммунной метки». Folia Histochemica et Cytobiologica . 43 (2): 81–90. PMID 16044945 . 
  17. ^ a b c d Рассел, Джон Дж. Боззола; Лонни Д. (1999). Электронная микроскопия: принципы и методы для биологов (2-е издание) (2-е изд.). Садбери, штат Массачусетс [ua]: Джонс и Бартлетт. стр. 5 и 9. ISBN 978-0-7637-0192-5.
  18. ^ Ким, Оливер (2009-01-22). «Электронные микроскопы против оптических (световых) микроскопов» . Журнал Microbehunter Microscopy . Проверено 4 мая 2013 .
  19. ^ Джордж, Эндрю JT; Urch, Кэтрин Э. (2000). Диагностические и терапевтические антитела . Тотова, Нью-Джерси: Humana Press. С. 439–452. ISBN 9781592590766.
  20. ^ Maeshima K, M Ельцов, Laemmli UK (ноябрь 2005). «Хромосомная структура: улучшенная иммунная метка для электронной микроскопии» (PDF) . Хромосома . 114 (5): 365–75. DOI : 10.1007 / s00412-005-0023-7 . PMID 16175370 . S2CID 14768368 .   
  21. ^ Ludi S, Frey J, Фавр D, Штоффель MH (апрель 2006). «Оценка экспрессии энтеротоксигенных поверхностных антигенов, специфичных для Escherichia coli, в рекомбинантных штаммах с помощью просвечивающей электронной микроскопии и иммуномечения» . J. Histochem. Cytochem . 54 (4): 473–7. DOI : 10.1369 / jhc.5A6794.2005 . PMID 16344328 . 
  22. Перейти ↑ Goldberg MW (2008). Иммуномечение для сканирующей электронной микроскопии (SEM) и автоэмиссионного SEM . Методы Cell Biol . Методы клеточной биологии. 88 . С. 109–30. DOI : 10.1016 / S0091-679X (08) 00407-X . ISBN 9780123743206. PMID  18617031 .
  23. ^ a b c Rosso F, Papale F, Barbarisi A (2013). «Экологическая сканирующая электронная микроскопия, иммуномечение золота в клеточной биологии». Методы визуализации клеток . Методы молекулярной биологии. 931 . С. 517–23. DOI : 10.1007 / 978-1-62703-056-4_27 . ISBN 978-1-62703-055-7. PMID  23027021 .
  24. ^ Нарайанан BK, Коварик L, Кинтана MA, Миллс MJ (2013). «Характеристика ферритных микроструктур сварных швов с использованием различных методов электронной микроскопии: обзор». Наука и технология сварки и соединения . 16 (1): 12–22. DOI : 10.1179 / 136217110X12720264008312 . ISSN 1362-1718 . S2CID 135581795 .  
  25. ^ Фолк WP, Taylor GM (ноябрь 1971). «Иммуноколлоидный метод для электронного микроскопа». Иммунохимия . 8 (11): 1081–3. DOI : 10.1016 / 0019-2791 (71) 90496-4 . PMID 4110101 . 
  26. ^ Owen GR, Meredith DO, Ар Gwynn I, Ричардс RG (2001). «Увеличение участков фокальной адгезии, меченных иммунным золотом, в фибробластах, культивируемых на металлических субстратах: проблемы и решения». Cell Biol. Int . 25 (12): 1251–9. DOI : 10,1006 / cbir.2001.0846 . PMID 11748918 . 

Внешние ссылки [ править ]

Библиотечные ресурсы об
иммунной метке
  • Ресурсы в вашей библиотеке
  • Ресурсы в других библиотеках
  • Процедуры маркировки
  • Молекулярный перекрестный обмен между механизмами транскрипции, трансляции и нонсенс-опосредованного распада
  • Техническая помощь по нанозондам: успешное иммуномечение с помощью ЭМ
  • Иммуномечение как инструмент для понимания пространственного распределения компонентов волоконной стенки и их биосинтетических ферментов