Перетасовка ДНК - это способ быстрого распространения полезных мутаций в эксперименте направленной эволюции . [1] Он используется для быстрого увеличения размера библиотеки ДНК . [2]
Процедура
Во- первых, ДНКазы используется для фрагментировать набор родительских генов на куски 50-100 пар оснований в длину. Затем следует полимеразная цепная реакция (ПЦР) без праймеров - фрагменты ДНК с достаточным количеством перекрывающихся гомологичных последовательностей отжигаются друг с другом, а затем удлиняются ДНК-полимеразой .
После того, как некоторые молекулы ДНК достигнут размера родительских генов , допускается проведение нескольких раундов этого расширения ПЦР . Затем эти гены можно амплифицировать с помощью другой ПЦР, на этот раз с добавлением праймеров , которые предназначены для дополнения концов цепей. Праймеры могут иметь дополнительные последовательности, добавленные к их 5'-концам, такие как последовательности сайтов узнавания рестрикционного фермента, необходимые для лигирования в вектор клонирования.
Можно рекомбинировать части этих генов для создания гибридов или химерных форм с уникальными свойствами, отсюда и термин «перетасовка ДНК». [3]
Методы перетасовки
Использование рестрикционных ферментов
- Ферменты рестрикции, которые разрезают в аналогичных местах, используются для переваривания членов семейства генов.
- Фрагменты ДНК соединяются вместе с ДНК-лигазой
- Производится большое количество гибридов, которые могут быть протестированы на уникальные свойства.
Использование ДНКазы 1
- Различные члены семейства генов фрагментируются с использованием ДНКазы 1 с последующей ПЦР.
- Во время ПЦР разные члены семейства подвергаются перекрестному праймированию, т.е. гомологические фрагменты ДНК отжигаются друг с другом.
- Сгенерированные гибриды затем используются для создания библиотеки мутантов, которые проверяются на уникальные свойства.
Смотрите также
Рекомендации
- ^ Чжао, Хуйминь; Арнольд, Фрэнсис Х. (1997). «Оптимизация перетасовки ДНК для высокоточной рекомбинации» (PDF) . Исследования нуклеиновых кислот . 25 (6): 1307–1308. DOI : 10.1093 / NAR / 25.6.1307 . PMC 146579 . PMID 9092645 .[ постоянная мертвая ссылка ]
- ^ Коэн, Дж. (13 июля 2001 г.). «Как работает перетасовка ДНК». Наука . 293 (5528): 237. DOI : 10.1126 / science.293.5528.237 . PMID 11452110 .
- ^ Бачер, Джейми М .; и другие. (2002). «Опережающая эволюция и перетасовка ДНК» . Геномная биология . 3 (8): отзывы 1021.1. DOI : 10.1186 / GB-2002-3-8-reviews1021 . PMC 139397 . PMID 12186650 .