FAIRE-Seq

Faire-seq ( F ormaldehyde- ssisted Я solation из R egulatory Е lements) представляет собой метод , в молекулярной биологии используется для определения последовательностей областей ДНК в геноме , связанный с регуляторной активностью. ^[1] Методика была разработана в лаборатории Джейсона Д. Либа в Университете Северной Каролины , Чапел-Хилл. В отличие от DNase-Seqпротокол FAIRE-Seq не требует пермеабилизации клеток или выделения ядер и может анализировать любой тип клеток. В исследовании семи различных типов клеток человека DNase-seq и FAIRE-seq дали сильную перекрестную проверку, при этом каждый тип клеток имел 1-2% генома человека в виде открытого хроматина .

Рабочий процесс [ править ]

Протокол основан на том факте, что сшивание формальдегидом более эффективно в ДНК, связанной с нуклеосомами, чем в областях генома, лишенных нуклеосом. Затем этот метод разделяет несшитую ДНК, которая обычно находится в открытом хроматине, которая затем секвенируется. Протокол состоит из перекрестного связывания, экстракции фенолом и секвенирования ДНК в водной фазе.

FAIRE [ править ]

FAIRE использует биохимические свойства связанной с белком ДНК для разделения областей генома, лишенных нуклеосом. Клетки будут подвергнуты перекрестному связыванию, гарантируя, что взаимодействие между нуклеосомами и ДНК зафиксировано. После обработки ультразвуком фрагментированную и фиксированную ДНК разделяют с использованием экстракции фенол-хлороформ. Этот метод создает две фазы: органическую и водную фазы. Благодаря своим биохимическим свойствам фрагменты ДНК, сшитые с нуклеосомами, будут предпочтительно находиться в органической фазе. С другой стороны, истощенные нуклеосомы или «открытые» области будут обнаружены в водной фазе. Путем специальной экстракции водной фазы будут очищены и обогащены только области, лишенные нуклеосом. ^[1]

Последовательность [ править ]

Фрагменты ДНК, выделенные FAIRE, могут быть проанализированы высокопроизводительным способом с использованием методов секвенирования следующего поколения . Как правило, библиотеки создаются путем лигирования конкретных адаптеров к фрагментам ДНК, которые позволяют им группироваться на платформе и амплифицироваться, что приводит к считыванию / определению последовательностей ДНК, и это параллельно для миллионов фрагментов ДНК.

В зависимости от размера генома, на котором выполняется FAIRE-seq, требуется минимум считываний, чтобы создать соответствующий охват данных, гарантирующий, что можно определить правильный сигнал. ^{[2] [3]} Кроме того, эталонный или входной геном, который не был перекрестно связан, часто секвенируется вместе с целью определения уровня фонового шума.

Обратите внимание, что извлеченные FAIRE-фрагменты могут быть количественно определены альтернативным методом с использованием количественной ПЦР . Однако этот метод не позволяет проводить высокопроизводительную количественную оценку извлеченных фрагментов по всему геному.

Чувствительность [ править ]

Есть несколько аспектов FAIRE-seq, которые требуют внимания при анализе и интерпретации данных. Во-первых, было заявлено, что FAIRE-seq будет иметь больший охват энхансерных областей по сравнению с промоторными областями. ^[4] Это контрастирует с альтернативным методом ДНКазы-seq, который, как известно, демонстрирует более высокую чувствительность к промоторным областям. Кроме того, было заявлено, что FAIRE-seq показывает предпочтения для внутренних интронов и экзонов. ^[5] В целом также считается, что данные FAIRE-seq отображают более высокий уровень фона, что делает этот метод менее чувствительным. ^[6]

Вычислительный анализ [ править ]

На первом этапе данные FAIRE-seq сопоставляются с эталонным геномом используемого модельного организма.

Затем идентификация участков генома с открытым хроматином выполняется с использованием алгоритма вызова пика. Различные инструменты предлагают пакеты для этого (например, ChIPOTle ^[7], ZINBA ^[8] и MACS2 ^[9] ). ChIPOTle использует скользящее окно размером 300 п.п. для выявления статистически значимых сигналов. Напротив, MACS2 идентифицирует расширенный сигнал, комбинируя параметр callpeak с другими опциями, такими как «широкий», «широкий отсечка», «без модели» или «сдвиг». ZINBA - это общий алгоритм для обнаружения обогащения в наборе данных для короткого чтения. ^[10] Таким образом, это помогает в точном обнаружении сигнала в сложных наборах данных с низким отношением сигнал / шум.

BedTools ^[11] используется для слияния обогащенных регионов, расположенных близко друг к другу, с образованием COREs (кластер открытых регуляторных элементов). Это помогает идентифицировать доступные для хроматина области и паттерны регуляции генов, которые в противном случае были бы необнаружимы, учитывая, что FAIRE-seq часто приносит с собой низкое разрешение.

Данные обычно визуализируются в виде треков (например, bigWig) и могут быть загружены в браузер генома UCSC. ^[12]

Главное ограничение этого метода, то есть низкое отношение сигнал / шум по сравнению с другими анализами доступности хроматина, делает вычислительную интерпретацию этих данных очень сложной. ^[13]

Альтернативные методы [ править ]

Есть несколько методов, которые можно использовать как альтернативу FAIRE-seq. DNase-seq использует способность фермента ДНКазы I расщеплять свободную / открытую / доступную ДНК для идентификации и секвенирования открытого хроматина. ^{[14] [15]} Впоследствии разработанный ATAC-seq использует транспозазу Tn5, которая вставляет определенные фрагменты или транспозоны в доступные области генома для идентификации и секвенирования открытого хроматина. ^[16]

Ссылки [ править ]