 | Эта статья может нуждаться в реорганизации, чтобы соответствовать рекомендациям Википедии по разметке . ( Апрель 2014 г. ) ( Узнайте, как и когда удалить этот шаблон сообщения ) |
Периодическая культура с подпиткой в самом широком смысле определяется как операционная техника в биотехнологических процессах, при которой одно или несколько питательных веществ (субстратов) подаются (поставляются) в биореактор во время культивирования и при котором продукт (-ы) остаются в биореакторе до тех пор, пока конец пробега. [1] Альтернативным описанием метода является культура, в которой «базовая среда поддерживает исходную культуру клеток, а питательная среда добавляется для предотвращения истощения питательных веществ». [2] Это также тип полупериодной культуры . В некоторых случаях все питательные вещества попадают в биореактор. Преимущество периодической культуры с подпиткой состоит в том, что можно контролировать концентрацию подпитываемого субстрата в культуральной жидкости на произвольно желаемых уровнях (во многих случаях на низких уровнях).
Вообще говоря, периодическая культура с подпиткой превосходит обычную периодическую культуру, когда контроль концентрации питательного вещества (или питательных веществ) влияет на выход или продуктивность желаемого метаболита.
Типы биопроцессов [ править ]
Типы биопроцессов, для которых эффективно культивирование с подпиткой, можно резюмировать следующим образом:
1. Ингибирование субстрата [1]
Питательные вещества, такие как метанол, этанол, уксусная кислота и ароматические соединения, подавляют рост микроорганизмов даже при относительно низких концентрациях. При правильном добавлении таких субстратов время задержки может быть сокращено, а ингибирование роста клеток заметно снижено.
2. Высокая плотность клеток (высокая концентрация клеток) [1]
В периодической культуре для достижения очень высоких концентраций клеток, например 50-100 г сухих клеток / л, необходимы высокие начальные концентрации питательных веществ в среде. При таких высоких концентрациях питательные вещества становятся ингибирующими, даже если они не имеют такого эффекта при обычных концентрациях, используемых в периодических культурах.
3. Эффект глюкозы ( эффект Крэбтри ) [1]
При производстве пекарских дрожжей из сусла или патоки с начала 1900-х годов было признано, что этанол производится даже в присутствии достаточного количества растворенного кислорода (DO), если в культуральной жидкости присутствует избыток сахара. Этанол - основная причина низкого выхода клеток. Образование аэробного этанола в присутствии концентрации глюкозы известно как эффект глюкозы или эффект Крэбтри. Чтобы уменьшить этот эффект, для производства пекарских дрожжей обычно используют периодический процесс с подпиткой. В аэробных культурах Escherichia coli и Bacillus subtilisорганические кислоты, такие как уксусная кислота (и в меньших количествах, молочная кислота и муравьиная кислота), образуются как побочные продукты при высокой концентрации сахара, и эти кислоты подавляют рост клеток, а также оказывают ухудшающее действие на метаболическую активность. Образование этих кислот называется бактериальным эффектом Крэбтри.
4. Подавление катаболитов [1]
Когда микроорганизм обеспечивается быстро метаболизируемым источником углеродной энергии, таким как глюкоза, результирующее увеличение внутриклеточной концентрации АТФ приводит к подавлению биосинтеза фермента (ов), тем самым вызывая более медленный метаболизм источника энергии. Это явление известно как катаболическая репрессия. Многие ферменты, особенно те, которые участвуют в катаболических путях, подвержены этой репрессивной регуляции. Мощный метод преодоления катаболитной репрессии в биосинтезе ферментов - это периодическая культура с подпиткой, в которой концентрация глюкозы в культуральной жидкости поддерживается на низком уровне, где рост ограничивается, а биосинтез фермента снижается. Замедленное введение глюкозы при ферментации пенициллина с помощью Penicillium chrysogenum является классическим примером в этой категории.
5. Ауксотрофные мутанты [1]
В микробном процессе, в котором используется ауксотрофный мутант (мутант, нуждающийся в питании), избыток необходимого питательного вещества приводит к обильному росту клеток с небольшим накоплением желаемого метаболита из-за ингибирования обратной связи и / или репрессии конечного продукта. Однако недостаток необходимого питательного вещества снижает рост клеток, а также общую продукцию желаемого метаболита, поскольку скорость продукции обычно пропорциональна концентрации клеток. В таком биопроцессе накопление желаемого метаболита может быть максимизировано путем выращивания мутанта на ограниченном количестве необходимого питательного вещества. Чтобы культивировать мутант при низкой концентрации необходимого питательного вещества, его вводят в периодическую культуру с контролируемой скоростью. Этот метод часто используется в промышленных производствах аминокислот с ауксотрофными мутантами.Примером является продукция лизина с помощью мутанта, требующего гомосерина или треонина / метионина.В Corynebacterium glutamicum отсутствует ген гомосериндегидрогеназы.
6. Контроль экспрессии гена с репрессируемым промотором.
Транскрипция гена, имеющего репрессируемый промотор перед открытой рамкой считывания, подавляется комбинацией так называемого голорепрессора с операторной областью на ДНК. Когда определенное химическое соединение существует в культуральной жидкости, это соединение (или его метаболит) в клетках объединяется в качестве корепрессора с апо-репрессором (своего рода транскрипционный фактор) с образованием голорепрессора. Сохранение концентрации этого соединения на минимально возможном уровне (при одновременном обеспечении достаточного роста клеток) позволяет продолжать экспрессию регулируемого гена. Пакетная культура с подпиской - мощный инструмент для этого. Примерами репрессируемого промотора являются промотор trp и промотор phoA .
7. Увеличение времени работы, добавление воды, теряемой при испарении, и снижение вязкости культурального бульона [1]
Типы стратегий культивирования [ править ]
Культура с высокой плотностью клеток [ править ]
Стратегия периодического действия с подпиткой обычно используется в биопромышленных процессах для достижения высокой плотности клеток в биореакторе . [3] [4] [5] [6] Обычно исходный раствор имеет высокую концентрацию, чтобы избежать разбавления биореактора. Производство гетерологичных белков с помощью периодических культур рекомбинантных микроорганизмов с подпиткой широко изучается. [7] [8] [9] [10]
Контролируемое добавление питательного вещества напрямую влияет на скорость роста культуры и помогает избежать избыточного метаболизма (образование побочных метаболитов, таких как ацетат для Escherichia coli , молочная кислота в культурах клеток млекопитающих, этанол в Saccharomyces cerevisiae ), ограничение кислорода (анаэробиоз). ). [11] [12]
Периодическая культура с постоянным кормлением [ править ]
Простейшая периодическая культура с подпиткой - это та, в которой скорость подачи ограничивающего рост субстрата постоянна, то есть скорость подачи неизменна во время культивирования. Этот случай показан на графике (здесь объем культуры переменный). Этот тип периодической культуры с подпиткой называется периодической культурой с постоянным кормлением (CFBC) и хорошо известен математически [13] и экспериментально. [14] В CFBC были изучены оба случая CFBC фиксированного и переменного объема.
Экспоненциально-периодическая культура [ править ]
В идеальных условиях клетки растут экспоненциально. Если скорость подачи ограничивающего рост субстрата увеличивается пропорционально экспоненциальной скорости роста клеток, можно поддерживать удельную скорость роста клеток в течение длительного времени, сохраняя при этом концентрацию субстрата в культуральной жидкости на постоянном уровне. уровень. Требуемая скорость подачи (объемная или массовая) должна увеличиваться экспоненциально со временем, так что этот режим периодической культуры с подпиткой называется периодической культурой с экспоненциальной подпиткой (EFBC). [15]
Ограничение субстрата дает возможность контролировать скорости реакции, чтобы избежать технологических ограничений, связанных с охлаждением реактора и переносом кислорода. Ограничение субстрата также позволяет контролировать метаболизм, чтобы избежать осмотических эффектов, подавления катаболитов и избыточного метаболизма побочных продуктов. [16] [17] [18]
Стратегия управления [ править ]
Для контроля роста в периодическом процессе с подпиткой можно использовать разные стратегии:
| Параметр управления | Принцип управления |
|---|---|
| ТОЧКА (pO 2 ) | DOstat (DOT = константа), F ~ DOT |
| Скорость поглощения кислорода (OUR) | OUR = константа, F ~ OUR |
| Глюкоза | оперативное измерение глюкозы (FIA), глюкоза = постоянная |
| Ацетат | оперативное измерение ацетата (FIA), ацетат = константа |
| pH (pHstat) | F ~ pH (закисление связано с высоким содержанием глюкозы) |
| Аммиак | оперативное измерение аммиака (FIA), аммиак = постоянный |
| Температура | T адаптировано согласно OUR или p O 2 |
Ссылки [ править ]
- ^ Цуее Яманэ, Шоичи Shimizu: подпитка метода в микробных процессах. Достижения в области биохимии / биотехнологии 1984, 30: 147-194.
- ^ Ngibuini Мваи (25 ноября 2014). «Как одноразовые мини-биореакторы могут революционизировать масштабирование биопроцессов» . Фармацевтическая обработка . США: Advantage Business Media.
- ^ Дитер Ризенберг: Культивирование Escherichia coli с высокой плотностью клеток. Curr Opin Biotechnol 1991, 2: 380-384.
- ^ Л. Йи, Харви В. Бланч: Экспрессия рекомбинантного белка в подпитываемых культурах Escherichia coli с высокой плотностью клеток. Bio / Technology (NY) 1992, 10: 1550-1556.
- ^ Сан Юп Ли: Культура Escherichia coli с высокой плотностью клеток. Trends Biotechnol 1996, 14: 98-105.
- ^ JosephShiloach, Rephael Fass: Выращивание E. coli до высокой плотности клеток - исторический взгляд на разработку метода. Biotechnol Adv 2005, 23: 345-357.
- ^ О Мендоза-Вега, Дж. Сабати, С. В. Браун: Промышленное производство гетерологичных белков с помощью периодических культур дрожжей Saccharomyces-cerevisiae . FEMS Microbiology Reviews 1994, 15: 369-410.
- ^ Паулина Балбас: Понимание искусства производства белковых и небелковых молекул в Escherichia coli. Молекулярная биотехнология 2001, 19: 251-267.
- ^ Neubauer P, Winter J: Стратегии экспрессии и ферментации для производства рекомбинантного белка в Escherichia coli . В: Merten OW et al. (Ред.). Продукция рекомбинантного белка прокариотическими и эукариотическими клетками. Сравнительный взгляд на физиологию хозяина. 2001 г., издательство Kluwer Academic Publisher, Дордрехт, Нидерланды. С. 195-258.
- ^ Амуля К. Панда: Биопроцессинг терапевтических белков из телец включения Escherichia coli . Adv Biochem Eng Biotechnol 2003, 85: 43-93.
- ^ Jeongseok Ли, Санг Ли Да, Сувон Park, Антон PJ Middelberg: управление подпиткой брожений. Biotechnol Adv 1999, 17: 29-48.
- ^ Кэти Ф. Влашин, Вэй-Шоу Ху: периодическая культура с подпиткой и динамическое кормление питательными веществами. Adv Biochem Engin / Biotechnol 2006, 101: 43-74.
- ^ Цунео Ямане, Сигеки Хирано: полупериодическая культура микроорганизмов с постоянной подачей субстрата - математическое моделирование -. J. Ferment Technol 1977, 55: 156-165.
- ^ Цунео Ямане, Сигеки Хирано: полупериодическая культура микроорганизмов с постоянной подачей субстрата - экспериментальное исследование -. J. Ferment Technol 1977, 55: 380-387.
- ^ Цунео Ямане, Мичимаса Кишимото, Фумитаке Ёсида: полупериодическая культура ассимилирующих метанол бактерий с экспоненциально увеличивающимся объемом подачи метанола. J. Ferment Technol 1974, 54: 229-240.
- ^ J. Zhang, Randolph Greasham: химически определенные среды для коммерческих ферментаций. Прикладная микробиология и биотехнология 1999, 51: 407-421.
- ^ Гуннар Лиден: Понимание биореактора. Биопроцесс и биосистема Engineering 2002, 24: 273-279.
- ^ Кристофер Дж. Хьюитт, Элвин В. Ниеноу: масштабирование микробных периодических и периодических процессов ферментации с подпиткой. Adv Appl Microbiol 2007, 62: 105-135.
