Флуоресцентная микроскопия для визуализации

Флуоресцентная микроскопия для визуализации времени жизни или FLIM - это метод визуализации, основанный на различиях в скорости экспоненциального затухания флуорофора в образце. Его можно использовать в качестве метода визуализации в конфокальной микроскопии , микроскопии с двухфотонным возбуждением и многофотонной томографии.

Время жизни (FLT) флуорофора, а не его интенсивность, используется для создания изображения в FLIM. Время жизни флуоресценции зависит от местной микросреды флуорофора, что исключает любые ошибочные измерения интенсивности флуоресценции из-за изменения яркости источника света, интенсивности фонового света или ограниченного фотообесцвечивания. Этот метод также имеет то преимущество, что сводит к минимуму эффект рассеяния фотонов в толстых слоях образца. Поскольку измерения времени жизни зависят от микросреды, они используются в качестве индикатора pH , ^[1] вязкости ^[2] и концентрации химических веществ. ^{[3] [4]}

Время жизни флуоресценции [ править ]

Флуорофор , который возбуждается с помощью фотона спадет до состояния с определенной вероятностью на основе скорости распада через ряд различных (радиационные и / или безызлучательные) пути распада. Чтобы наблюдать флуоресценцию, одним из этих путей должно быть спонтанное излучение фотона. В описании ансамбля испускаемая флуоресценция со временем затухает в соответствии с

${\ Displaystyle I (т) = I_ {0} е ^ {- т / \ тау}}$

где

${\ displaystyle {\ frac {1} {\ tau}} = \ сумма k_ {i}}$.

Выше это время, время жизни флуоресценции, начальная флуоресценция при и скорости для каждого пути распада, по крайней мере, одна из которых должна быть скоростью затухания флуоресценции . Что еще более важно, время жизни не зависит от начальной интенсивности и испускаемого света. Это можно использовать для проведения измерений, не основанных на интенсивности, при химическом зондировании. ^[5]${\ displaystyle t}$${\ Displaystyle \ тау}$${\ displaystyle I_ {0}}$${\ displaystyle t = 0}$${\displaystyle k_{i}}$${\displaystyle k_{f}}$${\displaystyle \tau }$

Измерение [ править ]

Визуализация флуоресценции-времени жизни дает изображения с интенсивностью каждого пикселя, определяемой с помощью , что позволяет просматривать контраст между материалами с разной скоростью затухания флуоресценции (даже если эти материалы флуоресцируют с точно такой же длиной волны), а также создает изображения, которые показывают изменения в других пути распада, например, при визуализации FRET .${\displaystyle \tau }$

Импульсное освещение [ править ]

Время жизни флуоресценции можно определить во временной области с помощью импульсного источника. Когда популяция флуорофоров возбуждается ультракоротким или дельта- импульсом света, флуоресценция с временным разрешением затухает экспоненциально, как описано выше. Однако, если возбуждающий импульс или отклик детектирования широкие, измеренная флуоресценция d (t) не будет чисто экспоненциальной. Инструментальная функция отклика IRF (t) будет свернута или смешана с функцией затухания F (t).

${\displaystyle {d}(t)={IRF}(t)\otimes {F}(t)}$

Инструментальный отклик источника, детектора и электроники можно измерить, обычно по рассеянному возбуждающему свету. Восстановление функции затухания (и соответствующих времен жизни) создает дополнительные проблемы, поскольку деление в частотной области имеет тенденцию производить высокий шум, когда знаменатель близок к нулю.

TCSPC [ править ]

Обычно используется коррелированный по времени подсчет одиночных фотонов ( TCSPC ), поскольку он компенсирует изменения в интенсивности источника и амплитуде импульсов одиночных фотонов. Используя коммерческое оборудование TCSPC, можно записать кривую затухания флуоресценции с временным разрешением до 405 фс. ^[6] Записанная гистограмма затухания флуоресценции подчиняется статистике Пуассона, которая учитывается при определении качества подгонки во время подгонки. В частности, TCSPC регистрирует время, в которое отдельные фотоны обнаруживаются быстрым однофотонным детектором (обычно фотоумножителем ( ФЭУ).) или однофотонный лавинный фотодиод (SPAD)) относительно возбуждающего лазерного импульса. Записи повторяются для нескольких лазерных импульсов, и после достаточного количества записанных событий можно построить гистограмму количества событий по всем этим записанным временным точкам. Затем эту гистограмму можно подогнать к экспоненциальной функции, которая содержит интересующую экспоненциальную функцию спада времени жизни, и, соответственно, можно извлечь параметр времени жизни. Многоканальные системы ФЭУ с 16 ^[7] до 64 элементов имеются в продаже, тогда как недавно продемонстрированные системы КМОП с однофотонным лавинным диодом (SPAD) -TCSPC FLIM могут предложить еще большее количество каналов обнаружения и дополнительные недорогие опции. ^[8]

Метод стробирования [ править ]

В этом методе до сих пор используется импульсное возбуждение. Прежде чем импульс достигнет образца, часть света отражается дихроичным зеркалом и обнаруживается фотодиодом, который активирует генератор задержки, управляющий стробируемым оптическим усилителем (GOI), который находится перед детектором CCD. GOI позволяет обнаруживать только ту часть времени, когда он открыт после задержки. Таким образом, с помощью настраиваемого генератора задержки можно собирать излучение флуоресценции после нескольких времен задержки, охватывающих временной диапазон затухания флуоресценции образца. ^{[9] [10]}В последние годы на рынок вышли интегрированные усиленные ПЗС-камеры. Эти камеры состоят из усилителя изображения, ПЗС-матрицы и встроенного генератора задержки. Камеры ICCD с самым коротким временем стробирования до 200ps и шагом задержки 10ps позволяют использовать FLIM с субнаносекундным разрешением. В сочетании с эндоскопом этот метод используется для интраоперационной диагностики опухолей головного мозга. ^[11]

Фазовая модуляция [ править ]

Время жизни флуоресценции можно определить в частотной области методом фазовой модуляции. В этом методе используется импульсный или модулированный на высокой частоте (до 500 МГц) источник света, такой как светодиод, диодный лазер или источник непрерывной волны в сочетании с электрооптическим модулятором или акустооптическим модулятором.. Флуоресценция (а) демодулируется и (б) сдвигается по фазе; обе величины связаны с характерными временами затухания флуорофора. Кроме того, y-компоненты для синусоидальных волн возбуждения и флуоресценции будут модулироваться, и время жизни может быть определено из коэффициента модуляции этих y-компонентов. Следовательно, 2 значения срока службы могут быть определены методом фазовой модуляции. Время жизни определяется путем подбора этих экспериментальных параметров. Преимуществом FLIM на основе PMT или камеры в частотной области является быстрое получение изображений в течение всего срока службы, что делает его пригодным для таких приложений, как исследование живых клеток. ^[12]

Анализ [ править ]

Цель алгоритма анализа состоит в том, чтобы извлечь кривую чистого распада из измеренного распада и оценить время жизни (а). Последнее обычно достигается путем подбора одно- или многоэкспоненциальных функций. Для решения этой проблемы было разработано множество методов. Наиболее широко используемый метод - это итеративная повторная свертка по методу наименьших квадратов, основанная на минимизации взвешенной суммы остатков. В этом методе теоретические кривые экспоненциального затухания свертываются с функцией отклика прибора, которая измеряется отдельно, и наилучшее соответствие находится путем итеративного вычисления остатков для различных входных данных до тех пор, пока не будет найден минимум. Для набора наблюдений сигнала флуоресценции во временном интервале i оценка срока службы выполняется путем минимизации:${\displaystyle d({{t}_{i}})}$

${\displaystyle {{\chi }^{2}}=\sum \limits _{i}{{\left[{{d}_{i}}({{t}_{i}})-{{d}_{0i}}({{t}_{i}},a,\tau )\right]}^{2}}}$

Помимо экспериментальных трудностей, включая функцию отклика прибора, зависящую от длины волны, математическая обработка итеративной задачи дек-свертки непроста, и это медленный процесс, который на заре FLIM сделал его непрактичным для попиксельного анализа. Неподходящие методы привлекательны, потому что они предлагают очень быстрое решение для оценки срока службы. Одним из основных и простых методов в этой категории является метод быстрого определения срока службы (RLD). RLD вычисляет времена жизни и их амплитуды напрямую, разделяя кривую затухания на две части равной ширины t. Анализ проводится путем интегрирования кривой затухания за равные промежутки времени t:${\displaystyle \delta }$${\displaystyle \delta }$

${\displaystyle {\begin{matrix}{{D}_{0}}=\sum \limits _{i=1}^{K/2}{{{I}_{i}}\delta t}&{{D}_{1}}=\sum \limits _{i=K/2}^{K}{{{I}_{i}}\delta t}\\\end{matrix}}}$

Ii - записанный сигнал в i-м канале, K - количество каналов. Срок службы можно оценить с помощью:

${\displaystyle \tau =\delta t/\ln({{D}_{0}}/{{D}_{1}})}$

Для многоэкспоненциальных распадов это уравнение дает среднее время жизни. Этот метод может быть расширен для анализа биэкспоненциальных распадов. Одним из основных недостатков этого метода является то, что он не может учитывать эффект отклика прибора, и по этой причине при анализе следует игнорировать раннюю часть измеренных кривых затухания. Это означает, что часть сигнала отбрасывается и точность оценки коротких времен жизни снижается.

Одна из интересных особенностей теоремы о свертке состоит в том, что интеграл свертки является произведением множителей, составляющих интеграл. Есть несколько методов, которые работают в преобразованном пространстве, которые используют это свойство для восстановления чистой кривой затухания из измеренной кривой. Преобразование Лапласа и Фурье вместе с разложением Лагерра по Гауссу использовалось для оценки времени жизни в преобразованном пространстве. Эти подходы быстрее, чем методы, основанные на деконволюции, но страдают от проблем с усечением и выборкой. Более того, применение таких методов, как разложение Лагерра-Гаусса, математически сложно. В методах Фурье время жизни одной экспоненциальной кривой спада определяется как:

${\displaystyle \tau ={\frac {1}{n\omega }}{\frac {{A}_{n}}{{B}_{n}}}}$

Где:

${\displaystyle {\begin{matrix}{{A}_{n}}={\frac {\sum \limits _{t}{d(t)\sin(n\omega t)}}{\sum \limits _{t}{IRF(t)\sin(n\omega t)}}}={\frac {\omega \tau }{1+{{\omega }^{2}}{{\tau }^{2}}}},&{{B}_{n}}={\frac {\sum \limits _{t}{d(t)\cos(n\omega t)}}{\sum \limits _{t}{IRF\cos(n\omega t)}}}={\frac {1}{1+n{{\omega }^{2}}{{\tau }^{2}}}},&\omega ={\frac {2\pi }{T}}\\\end{matrix}}}$

n - номер гармоники, а T - общий временной диапазон обнаружения.

Приложения [ править ]

FLIM в первую очередь использовался в биологии как метод обнаружения фотосенсибилизаторов в клетках и опухолях, а также FRET в тех случаях, когда ратиометрическая визуализация затруднена. Этот метод был разработан в конце 1980-х - начале 1990-х годов (метод Гейтинга: Bugiel et al. 1989. König 1989, ^[13] Фазовая модуляция: Lakowicz et al. 1992, ^{[14] [15]} ) до более широкого применения в конец 1990-х. В культуре клеток он был использован для изучения передачи сигналов рецептора EGF ^[16] и трафика. ^[17] Временная область FLIM (tdFLIM) также использовалась для демонстрации взаимодействия обоих типов ядерных белков промежуточных филаментов ламинов A и B1 в различных гомополимерах ядерной оболочки, которые в дальнейшем взаимодействуют друг с другом в структурах более высокого порядка. ^[18] Визуализация FLIM особенно полезна в нейронах, где рассеяние света тканью мозга проблематично для логометрической визуализации. ^[19] В нейронах визуализация FLIM с использованием импульсного освещения использовалась для изучения белков семейства Ras , ^[20] CaMKII , Rac и Ran ^[21] . FLIM использовался в клинической многофотонной томографии для обнаружения внутрикожных раковых клеток, а также фармацевтических и косметических соединений.

Совсем недавно FLIM также был использован для обнаружения флаванолов в растительных клетках ^[22]

Изображение FRET [ править ]

Поскольку время жизни флуоресценции флуорофора зависит как от радиационных (то есть флуоресценции), так и от безызлучательных (то есть тушение, FRET) процессов, передача энергии от молекулы донора к молекуле акцептора уменьшит время жизни донора. Таким образом, измерения FRET с использованием FLIM могут предоставить метод различения состояний / окружения флуорофора. ^[23] В отличие от измерений FRET на основе интенсивности, измерения FRET на основе FLIM также нечувствительны к концентрации флуорофоров и, таким образом, могут отфильтровывать артефакты, вызванные изменениями концентрации и интенсивности излучения в образце.

См. Также [ править ]

• Фазорный подход к времени жизни флуоресценции и построению спектральных изображений

Ссылки [ править ]

Внешние ссылки [ править ]

• Визуализация в возбужденном состоянии флуоресценции в течение всей жизни
• Инструменты анализа времени жизни и спектрального анализа в ImageJ: http://spechron.com
• Флуоресцентная микроскопия для визуализации на протяжении всей жизни
• Принцип TCSPC FLIM (Becker & Hickl GmbH)