Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Белки, разделенные с помощью SDS-PAGE , окрашивания кумасси бриллиантовым синим

Электрофорез белков - это метод анализа белков в жидкости или экстракте. Электрофорез может проводиться с небольшим объемом образца рядом альтернативных способов с использованием или без поддерживающей среды: электрофорез в полиакриламидном геле с SDS (коротко: гель-электрофорез, PAGE или SDS-электрофорез), электрофорез в свободном потоке , электрофокусирование , изотахофорез , аффинный электрофорез , иммуноэлектрофорез , контрэлектрофорез и капиллярный электрофорез . Каждый метод имеет множество вариаций с индивидуальными преимуществами и ограничениями. Гель-электрофорезчасто выполняется в сочетании с электроблоттингом и иммуноблоттингом для получения дополнительной информации о конкретном белке. Из-за практических ограничений электрофорез белков обычно не подходит в качестве препаративного метода. [ требуется разъяснение ]

Денатурирующие гелевые методы [ править ]

SDS-PAGE [ править ]

Основная статья: SDS-PAGE

SDS-PAGE, электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия , описывает набор родственных методов для разделения белков в соответствии с их электрофоретической подвижностью (функция молекулярной массы полипептидной цепи) в денатурированном (развернутом) состоянии. В большинстве белков связывание SDS с полипептидной цепью обеспечивает равномерное распределение заряда на единицу массы, что приводит к фракционированию по приблизительному размеру во время электрофореза.

SDS - это сильнодействующий детергент, используемый для денатурирования нативных белков до развернутых индивидуальных полипептидов . Когда белковая смесь нагревается до 100 ° C в присутствии SDS, детергент обволакивает полипептидный каркас. В этом процессе собственные заряды полипептидов становятся незначительными по сравнению с отрицательными зарядами, вносимыми SDS. Таким образом, полипептиды после обработки становятся стержневидными структурами, обладающими однородной плотностью заряда, то есть одинаковым суммарным отрицательным зарядом на единицу длины. Электрофоретическая подвижность этих белков будет линейной функцией логарифмов их молекулярных масс.

Нативные гелевые методы [ править ]

Нативные гели, также известные как неденатурирующие гели, анализируют белки, которые все еще находятся в свернутом состоянии. Таким образом, электрофоретическая подвижность зависит не только от отношения заряда к массе, но также от физической формы и размера белка.

Синяя родная СТРАНИЦА [ править ]

BN-PAGE - это нативный метод PAGE , в котором краситель кумасси бриллиантовый синий обеспечивает необходимые заряды для белковых комплексов для электрофоретического разделения. [1] [2] Недостатком кумасси является то, что при связывании с белками он может действовать как детергент, вызывая диссоциацию комплексов . Другим недостатком является потенциальная закалка из хемилюминесценции (например , в последующем Вестерн - блот - детекции или анализов активности) или флуоресценции белков с протезами группами (например , гема или хлорофиллом) или помеченные флуоресцентными красителями.

Очистить родную СТРАНИЦУ [ изменить ]

CN-PAGE (обычно называемый Native PAGE) разделяет кислые водорастворимые и мембранные белки в полиакриламидном градиентном геле. Он не использует заряженный краситель, поэтому электрофоретическая подвижность белков в CN-PAGE (в отличие от метода сдвига заряда BN-PAGE) связана с внутренним зарядом белков. [3] Расстояние миграции зависит от заряда белка, его размера и размера пор геля. Во многих случаях этот метод имеет более низкое разрешение, чем BN-PAGE, но CN-PAGE предлагает преимущества всякий раз, когда краситель кумасси мешает дальнейшим аналитическим методам, например, он был описан как очень эффективный метод разделения на микромасштабе для FRET- анализов. [4]Кроме того, CN-PAGE более мягкий, чем BN-PAGE, поэтому он может сохранять лабильные супрамолекулярные сборки комплексов мембранных белков , которые диссоциируют в условиях BN-PAGE.

Количественная собственная страница PAGE [ править ]

Основная статья: QPNC-PAGE

Представляющие интерес свернутые белковые комплексы разделяются чисто и предсказуемо благодаря специфическим свойствам полиакриламидного геля. Разделенные белки непрерывно элюируются физиологическим элюентом и транспортируются в коллектор фракций. В четырех-пяти фракциях PAGE каждый металлический кофактор может быть идентифицирован и абсолютно количественно определен с помощью ICP-MS высокого разрешения . Соответствующие структуры изолированных металлопротеинов можно определить с помощью спектроскопии ЯМР в растворе . [5]

Буферные системы [ править ]

Постулируемая миграция белков в гелевой системе Лэммли A: Укладывающий гель, B: Рассасывающийся гель, o: нанесение образца c: неоднородности в буфере и электрофоретической матрице

Большинство разделений белков выполняется с использованием "прерывистой" (или DISC) буферной системы, которая значительно увеличивает резкость полос внутри геля. Во время электрофореза в прерывистой гелевой системе на ранней стадии электрофореза образуется ионный градиент, который заставляет все белки фокусироваться в единую резкую полосу. Формирование ионного градиента достигается за счет выбора значения pH, при котором ионы буфера заряжены только умеренно по сравнению с белками, покрытыми SDS. Эти условия создают среду, в которой реакции Кольрауша определяют молярную проводимость.. В результате белки, покрытые SDS, концентрируются в несколько раз в тонкой зоне размером порядка 19 мкм в течение нескольких минут. На этой стадии все белки мигрируют с одинаковой скоростью миграции за счет изотахофореза . Это происходит в области геля, которая имеет более крупные поры, так что гелевая матрица не задерживает миграцию во время фокусировки или «наложения». [6] [7]Разделение белков по размеру достигается в нижней, «разрешающейся» области геля. Разделительный гель обычно имеет гораздо меньший размер пор, что приводит к эффекту просеивания, который теперь определяет электрофоретическую подвижность белков. В то же время разделяющая часть геля также имеет значение pH, при котором ионы буфера в среднем несут больший заряд, заставляя их «опережать» белки, покрытые SDS, и устранять ионный градиент и тем самым эффект суммирования.

Очень распространенной прерывистой буферной системой является система трис-глицина или « Лэммли », которая складывается при pH 6,8 и растворяется при pH ~ 8,3-9,0. Недостатком этой системы является то, что эти значения pH могут способствовать образованию дисульфидной связи между остатками цистеина в белках, потому что pKa цистеина находится в диапазоне от 8 до 9 и поскольку восстанавливающий агент, присутствующий в загрузочном буфере, не мигрирует вместе с белками. Последние достижения в технологии буферизации облегчают эту проблему, разрешая белки при pH значительно ниже pKa цистеина (например, бис-трис, pH 6,5) и включают восстановители (например, бисульфит натрия), которые переходят в гель перед белками, чтобы поддерживать восстановительную среду. Дополнительным преимуществом использования буферов с более низкими значениями pH является то, что акриламидный гель более стабилен при более низких значениях pH, поэтому гели можно хранить в течение длительных периодов времени перед использованием. [8] [9]

SDS-градиентный гель-электрофорез белков [ править ]

При приложении напряжения анионы (и отрицательно заряженные молекулы образца) перемещаются к положительному электроду (аноду) в нижней камере, ведущим ионом является Cl - (высокая подвижность и высокая концентрация); глицинат является замыкающим ионом (низкая подвижность и низкая концентрация). Частицы SDS-белка не перемещаются свободно на границе между Cl - гелевого буфера и Gly - катодного буфера. Фридрих Кольрауш обнаружил, что закон Ома также применим к растворенным электролитам . Из - за падения напряжения между Cl - и глицин-буферы, белки сжаты (уложены) в микрометрических тонких слоев. [10] Граница движется через градиент пор, и стек белков постепенно диспергируется из-за увеличения сопротивления трения гелевой матрицы. Укладка и разборка происходит непрерывно в градиентном геле для каждого белка в разных местах. Для полного разделения белка концентрация полиакриламидного геля должна превышать 16% T. Двухгелевая система «Laemmli» представляет собой простой градиентный гель. Неравномерность pH буферов не имеет значения для качества разделения, и «стекинг-гель» с другим pH не требуется.

Визуализация [ править ]

Самым популярным белковым красителем является кумасси бриллиантовый синий . Это анионный краситель, который неспецифически связывается с белками. Белки в геле фиксируются уксусной кислотой и одновременно окрашиваются. Избыток красителя, включенного в гель, можно удалить, обесцвечивая тем же раствором без красителя. Белки обнаруживаются в виде синих полос на прозрачном фоне.

Когда требуется более чувствительный метод, чем окрашивание Кумасси, обычно используется окрашивание серебром. Окрашивание серебром - чувствительная процедура для обнаружения следовых количеств белков в гелях, но также может визуализировать нуклеиновые кислоты или полисахариды.

На рынке доступны методы визуализации без использования красителей, таких как кумасси и серебро. Например, Bio-Rad Laboratories продает гели без пятен для электрофореза в геле SDS-PAGE. В качестве альтернативы можно использовать обратимые флуоресцентные красители из Azure Biosystems, такие как AzureRed или Azure TotalStain Q.

Так же, как и в гель-электрофорезе нуклеиновых кислот, часто используется трекинг-краситель . В буфер для образца обычно включают анионные красители с известной электрофоретической подвижностью. Очень распространенный следящий краситель - это бромфеноловый синий . Этот краситель окрашен при щелочном и нейтральном pH и представляет собой небольшую отрицательно заряженную молекулу, которая движется к аноду. Будучи высокомобильной молекулой, он опережает большинство белков.

Медицинские приложения [ править ]

Схематическое изображение геля для электрофореза белков.
Электрофорез сывороточного протеина показывает парапротеин (пик в гамма-зоне) у пациента с множественной миеломой .
Основные статьи: Электрофорез белков сыворотки и белки крови

В медицине , белок - электрофорез представляет собой метод анализа белков в основном в сыворотке крови . До широкого использования гель-электрофореза электрофорез белков выполняли как электрофорез в свободном потоке (на бумаге) или как иммуноэлектрофорез.

Традиционно рассматриваются два класса белков крови : сывороточный альбумин и глобулин . Как правило, они равны по пропорции, но альбумин как молекула намного меньше и имеет слабый отрицательный заряд, что приводит к накоплению альбумина на электрофоретическом геле. Небольшая полоса перед альбумином представляет транстиретин (также называемый преальбумином). Некоторые лекарственные препараты или химические вещества в организме могут вызвать образование собственной полосы, но обычно она небольшая. Аномальные полосы (спайки) наблюдаются при моноклональной гаммопатии неопределенного значения и множественной миеломе и полезны при диагностике этих состояний.

Глобулины классифицируются по рисунку полос (с их основными представителями):

  • Полоса альфа (α) состоит из двух частей, 1 и 2:
    • α 1 - α 1 -антитрипсин , α 1 -кислый гликопротеин.
    • α 2 - гаптоглобин , α 2 -макроглобулин , α 2 -антиплазмин , церулоплазмин .
  • Бета (β) группы - трансферрина , ЛПНП , комплемент
  • Гамма (γ) группа - иммуноглобулин (IgA, IgD, IgE, IgG и IgM). В этой полосе обычно появляются парапротеины (при множественной миеломе).

Обычная медицинская процедура в настоящее время включает определение множества белков в плазме, включая гормоны и ферменты, некоторые из которых также определяются с помощью электрофореза. Однако гель-электрофорез - это в основном инструмент исследования, в том числе и в случае белков крови.

См. Также [ править ]

  • Аффинный электрофорез
  • Электроблоттинг
  • Электрофокусировка
  • Электрофорез в полиакриламидном геле, ПААГ или гель-электрофорез
  • Иммуноэлектрофорез
  • Иммунофиксация
  • SDD-AGE
  • Нативный гель-электрофорез
  • QPNC-PAGE
  • Парапротеин
  • Быстрый параллельный протеолиз (FASTpp) [11]

Ссылки [ править ]

  1. ^ Schägger, H .; Ягов, Г. (1991). «Синий нативный электрофорез для выделения комплексов мембранных белков в ферментативно активной форме». Анальный. Biochem . 199 (2): 223–231. DOI : 10.1016 / 0003-2697 (91) 90094-A . PMID  1812789 .
  2. ^ Виттиг, I .; Браун, HP; Шеггер, Х. (2006). "Голубая родная СТРАНИЦА". Nat. Protoc . 1 (1): 418–428. DOI : 10.1038 / nprot.2006.62 . PMID 17406264 . 
  3. ^ Виттиг, I .; Шеггер, Х. (ноябрь 2005 г.). «Преимущества и недостатки чистой страницы PAGE» . Протеомика . 5 (17): 4338–46. DOI : 10.1002 / pmic.200500081 . PMID 16220535 . Архивировано из оригинала на 2013-01-05. 
  4. ^ Гэвин П.Д.; Девениш RJ; Прескотт М. (2003). «FRET выявляет изменения во взаимодействии F 1 со стеблем статора во время активности F 1 F 0 -АТФ синтазы». Biochim Biophys Acta . 1607 (2–3): 167–79. DOI : 10.1016 / j.bbabio.2003.09.013 . PMID 14670607 . 
  5. ^ Kastenholz, B. (2004). «Препаративный нативный непрерывный электрофорез в полиакриламидном геле (PNC ‐ PAGE): эффективный метод выделения кофакторов кадмия в биологических системах». Protein Pept Lett . 37 (4): 657–65. DOI : 10.1081 / AL-120029742 . S2CID 97636537 . 
  6. ↑ Орнштейн L (декабрь 1964 г.). «Дисковый электрофорез. I. Предпосылки и теория». Летопись Нью-Йоркской академии наук . 121 (2): 321–349. Bibcode : 1964NYASA.121..321O . CiteSeerX 10.1.1.140.7598 . DOI : 10.1111 / j.1749-6632.1964.tb14207.x . PMID 14240533 .  
  7. ^ Дэвис BJ (декабрь 1964). «Дисковый электрофорез. 2, Метод и применение к белкам сыворотки крови человека». Анна. NY Acad. Sci . 121 (2): 404–427. Bibcode : 1964NYASA.121..404D . DOI : 10.1111 / j.1749-6632.1964.tb14213.x . PMID 14240539 . 
  8. ^ Schägger Н, фон Яги G (1987). «Электрофорез в трицин-додецилсульфат-полиакриламидном геле для разделения белков в диапазоне от 1 до 100 кДа». Анальный. Biochem . 166 (2): 368–379. DOI : 10.1016 / 0003-2697 (87) 90587-2 . PMID 2449095 . 
  9. ^ Wiltfang Дж, Arold Н, Neuhoff В (1991). «Новая многофазная буферная система для электрофореза в полиакриламидном геле додецилсульфата натрия белков и пептидов с молекулярными массами 100000-1000 и их обнаружения с пикомолярной чувствительностью». Электрофорез . 12 (5): 352–366. DOI : 10.1002 / elps.1150120507 . PMID 1718736 . 
  10. ^ Кольрауш F (1897). "Ueber Concentrations-Verschiebungen durch Electrolyse im Inneren von Lösungen und Lösungsgemischen" . Annalen der Physik und Chemie . 62 (10): 209–239. Bibcode : 1897AnP ... 298..209K . DOI : 10.1002 / andp.18972981002 .
  11. ^ Minde DP (2012). «Определение биофизической стабильности белков в лизатах с помощью анализа быстрого протеолиза, FASTpp» . PLOS ONE . 7 (10): e46147. Bibcode : 2012PLoSO ... 746147M . DOI : 10.1371 / journal.pone.0046147 . PMC 3463568 . PMID 23056252 .  

Внешние ссылки [ править ]

  • Образовательный ресурс по электрофорезу белков
  • Гель-электрофорез белков