Множественное усиление смещения
Из Википедии, свободной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

Амплификация с множественным замещением (MDA) представляет собой метод амплификации ДНК . Этот метод может быстро амплифицировать мельчайшие количества образцов ДНК до приемлемого количества для геномного анализа. Реакция начинается с отжига случайных гексамерных праймеров с матрицей: синтез ДНК осуществляется высокоточным ферментом , преимущественно ДНК-полимеразой Φ29 . По сравнению с обычными методами амплификации ПЦР , MDA не использует специфичные для последовательности праймеры, а амплифицирует всю ДНК, генерирует продукты большего размера с более низкой частотой ошибок и работает при постоянной температуре. MDA активно используется для полногеномной амплификации .(WGA) и является многообещающим методом для применения к секвенированию генома одной клетки и генетическим исследованиям на основе секвенирования.

Задний план

Многие биологические и судебно -медицинские дела, связанные с генетическим анализом, требуют секвенирования ДНК из небольшого количества образцов, таких как ДНК из некультивируемых одиночных клеток или следовых количеств тканей, собранных с места преступления. Обычные методы амплификации ДНК, основанные на полимеразной цепной реакции ( ПЦР ), требуют специфичных для последовательности олигонуклеотидных праймеров и термостабильной (обычно Taq ) полимеразы и могут использоваться для создания значительных количеств ДНК из мельчайших количеств ДНК. Однако этого недостаточно для современных методов, использующих анализ ДНК на основе секвенирования. Следовательно, необходим более эффективный метод, не зависящий от последовательности, для амплификации мельчайших количеств ДНК, особенно в исследованиях генома одной клетки.

Материалы

Стадии реакции МДА

ДНК-полимераза Phi 29

ДНК-полимераза бактериофага Φ29 представляет собой высокопроизводительный фермент , который может продуцировать ампликоны ДНК размером более 70 тысяч пар оснований. [1] Его высокая точность и 3'–5'-корректорная активность снижают частоту ошибок амплификации до 1 на 10 6 -10 7 оснований по сравнению с обычной Taq - полимеразой с зарегистрированной частотой ошибок 1 на 9000. [2] Реакцию можно проводить при умеренной изотермической температуре 30 °C, поэтому термоциклер не требуется . Он активно используется в бесклеточном клонировании — ферментативном методе амплификации ДНК in vitro без культивирования клеток иЭкстракция ДНК . Большой фрагмент ДНК-полимеразы Bst также используется в MDA, но Ф29 обычно предпочтительнее из-за его достаточного выхода продукта и корректирующей активности. [3]

Гексамерные грунтовки

Гексамерные праймеры представляют собой последовательности, состоящие из шести случайных нуклеотидов . Для применения MDA эти праймеры обычно модифицированы тиофосфатом на их 3'-конце, чтобы передать устойчивость к 3'-5' экзонуклеазной активности ДНК- полимеразы Ф29 . Реакции MDA начинаются с отжига таких праймеров на ДНК-матрице с последующим удлинением цепи, опосредованным полимеразой. В ходе реакции амплификации происходит все больше событий отжига праймеров.

реакция

Реакция амплификации инициируется, когда несколько гексамеров праймеров отжигаются на матрице. Когда синтез ДНК переходит к следующему стартовому сайту, полимераза вытесняет новообразованную цепь ДНК и продолжает ее удлинение. Смещение цепи создает вновь синтезированную одноцепочечную ДНК-матрицу для отжига большего количества праймеров. Дальнейший отжиг праймеров и смещение цепи на вновь синтезированной матрице приводит к гиперразветвленной сети ДНК. Деветвление последовательности во время амплификации приводит к высокому выходу продуктов. Для разделения сети ветвления ДНК используются нуклеазы S1 , расщепляющие фрагменты в местах смещения. Разрывы на полученных фрагментах ДНК восстанавливаются ДНК-полимеразой I.

Секвенирование генома одной клетки (MDA).JPG.

Качество продукта

MDA может генерировать 1–2 мкг ДНК из одной клетки с охватом генома до 99%. [4] Продукты также имеют более низкий уровень ошибок и большие размеры по сравнению с Taq - амплификации на основе ПЦР. [4] [5]

Общий рабочий процесс MDA: [6]

  1. Подготовка образца : Образцы собирают и разбавляют соответствующим реакционным буфером (без Ca 2+ и Mg 2+ ). Клетки лизируют щелочным буфером .
  2. Условия : Реакцию МДА с полимеразой Ф29 проводят при 30°С. Реакция обычно занимает около 2,5–3 часов.
  3. Конец реакции : ферменты инактивируют при 65 °C перед сбором амплифицированных продуктов ДНК.
  4. Продукты ДНК можно очистить с помощью коммерческого набора для очистки.

Преимущества

МДА дает достаточный выход продуктов ДНК. Это мощный инструмент амплификации молекул ДНК из образцов, таких как некультивируемые микроорганизмы или отдельные клетки, до количества, достаточного для проведения секвенирования . Большой размер продуктов ДНК, амплифицированных MDA, также обеспечивает желаемое качество образцов для определения размера аллелей полиморфных повторов. Его высокая точность также делает его надежным для использования при обнаружении аллеля однонуклеотидного полиморфизма (SNP). Благодаря смещению нитей при амплификации амплифицированная ДНК имеет достаточное покрытие исходных молекул ДНК, что обеспечивает высококачественный продукт для геномного анализа. Продукты смещенных цепей могут быть впоследствии клонированы в векторы для создания библиотеки для последующего секвенирования . реакции.

Ограничения

Выпадение аллелей (ADO)

ADO определяется как случайная неамплификация одного из аллелей , присутствующих в гетерозиготном образце. В некоторых исследованиях сообщается, что уровень ADO для продуктов MDA составляет 0–60%. [7] Этот недостаток снижает точность генотипирования одного образца и ошибочный диагноз в других приложениях, связанных с MDA. ADO, по-видимому, не зависит от размеров фрагментов и, как сообщается, имеет аналогичную скорость в других методах одноклеточных. Возможными решениями являются использование различных условий лизиса или проведение нескольких циклов амплификации из разведенных продуктов MDA, поскольку сообщалось, что опосредованная ПЦР амплификация из культивируемых клеток дает более низкие показатели ADO.

Предпочтительное усиление

«Предпочтительная амплификация» — это чрезмерная амплификация одного из аллелей по сравнению с другим. Большинство исследований MDA сообщали об этой проблеме. Смещение усиления в настоящее время наблюдается как случайное. Это может повлиять на анализ небольших участков геномной ДНК при идентификации аллелей коротких тандемных повторов (STR).

Взаимодействие праймер-праймер

Эндогенное, независимое от матрицы взаимодействие праймер-праймер обусловлено случайным дизайном гексамерных праймеров. Одним из возможных решений является разработка ограниченно-рандомизированных гексануклеотидных праймеров, которые не дают перекрестной гибридизации.

Приложения

Секвенирование генома одной клетки

С помощью МДА секвенированы одиночные клетки некультивируемых бактерий, архей и протистов, а также отдельные вирусные частицы и единичные споры грибов . [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18]

Способность секвенировать отдельные клетки также полезна в борьбе с болезнями человека. Геномы из отдельных эмбриональных клеток человека были успешно амплифицированы для секвенирования с использованием MDA, что позволяет проводить преимплантационную генетическую диагностику (PGD): скрининг генетических проблем со здоровьем у эмбриона на ранней стадии перед имплантацией . [19] Заболевания с гетерогенными свойствами, такие как рак , также выигрывают от способности секвенирования генома на основе MDA изучать мутации в отдельных клетках.

Продукты MDA из одной клетки также успешно использовались в экспериментах по сравнительной геномной гибридизации , которые обычно требуют относительно большого количества амплифицированной ДНК.

Иммунопреципитация хроматина

Иммунопреципитация хроматина приводит к образованию сложных смесей относительно коротких фрагментов ДНК, которые трудно амплифицировать с помощью MDA, не вызывая систематической ошибки в представлении фрагментов. Был предложен способ обойти эту проблему, основанный на превращении этих смесей в кольцевые конкатемеры с помощью лигирования с последующим применением MDA, опосредованного ДНК-полимеразой Φ29. [20]

Судебно-медицинский анализ

Следовое количество образцов, собранных с места преступления, может быть увеличено с помощью MDA до количества, достаточного для судебно-медицинского анализа ДНК, который обычно используется при идентификации жертв и подозреваемых.

Смотрите также

  • Полимеразной цепной реакции
  • Полногеномная амплификация

использованная литература

  1. ^ Бланко Л., Бернад А., Ласаро Дж. М., Мартин Г., Гармендиа С., Салас М. (1989). «Высокоэффективный синтез ДНК ДНК-полимеразой фага phi 29. Симметричный способ репликации ДНК» . Журнал биологической химии . 264 (15): 8935–40. doi : 10.1016/S0021-9258(18)81883-X . PMID  2498321 .
  2. ^ Тиндалл К.Р. и Кункель Т.А. (1988). «Точность синтеза ДНК ДНК-полимеразой Thermus aquaticus». Биохимия . 27 (16): 6008–13. дои : 10.1021/bi00416a027 . PMID 2847780 . 
  3. ^ Хатчисон, Калифорния; Смит, ХО; Пфаннкох, С; Вентер, Дж. К. (2005). «Бесклеточное клонирование с использованием ДНК-полимеразы φ29» . Труды Национальной академии наук . 102 (48): 17332–17. Бибкод : 2005PNAS..10217332H . doi : 10.1073/pnas.0508809102 . ПВК 1283157 . PMID 16286637 .  
  4. ^ a b Паес Дж. Г., Лин М., Бероухим Р., Ли Дж. К., Чжао Х, Рихтер Д. Д., Габриэль С., Герман П., Сасаки Х., Альтшулер Д., Ли С., Мейерсон М., Селлерс В. Р. (2004). «Покрытие генома и точность последовательности амплификации всего генома с множественным замещением цепи на основе полимеразы phi29» . Исследование нуклеиновых кислот . 32 (9): е71. doi : 10.1093/nar/gnh069 . ПВК 419624 . PMID 15150323 .  
  5. ^ Эстебан Дж. А., Салас М., Бланко Л. (1993). «Точность ДНК-полимеразы phi 29. Сравнение инициации с белком и полимеризации ДНК» . Журнал биологической химии . 268 (4): 2719–26. doi : 10.1016/S0021-9258(18)53833-3 . PMID 8428945 . 
  6. ^ Плевать; Ле Кенек, К; Де Райк, М.; Ван От, Л; Ван Стейртегем, А; Либэрс, я; Проповедь, К. (2006). «Полногеномная амплификация с множественным замещением из одиночных клеток». Протоколы природы . 1 (4): 1965–70. doi : 10.1038/nprot.2006.326 . PMID 17487184 . S2CID 33346321 .  
  7. ^ Брэдли, Уорд, Ярборо (2012). «Скорость выпадения аллелей при амплификации с множественным смещением». Прикладные биомолекулярные методы . 84 (51): 341–362.CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  8. ^ Чжан; Мартини, AC; Реппас, Н.Б.; Барри, кВт; Малек, Дж.; Чисхолм, ЮЗ; Черч, GM (2006). «Секвенирование геномов из отдельных клеток с помощью полимеразного клонирования». Природная биотехнология . 24 (6): 680–6. дои : 10.1038/nbt1214 . PMID 16732271 . S2CID 2994579 .  
  9. ^ Степанаускас, Рамунас; Серацкий, Майкл Э. (22 мая 2007 г.). «Соответствие филогении и метаболизма некультивируемых морских бактерий, по одной клетке за раз» . Труды Национальной академии наук . 104 (21): 9052–9057. Бибкод : 2007PNAS..104.9052S . doi : 10.1073/pnas.0700496104 . ISSN 0027-8424 . ПВК 1885626 . PMID 17502618 .   
  10. ^ Юн, Хван Су; Прайс, Дана С .; Степанаускас, Рамунас; Раджа, Виран Д.; Серацкий, Майкл Э .; Уилсон, Уильям Х .; Ян, Ын Чан; Даффи, Сиобейн; Бхаттачарья, Дебашиш (06 мая 2011 г.). «Одноклеточная геномика выявляет взаимодействия организмов у некультивируемых морских протистов». Наука . 332 (6030): 714–717. Бибкод : 2011Sci...332..714Y . doi : 10.1126/science.1203163 . ISSN 0036-8075 . PMID 21551060 . S2CID 34343205 .   
  11. ^ Лебедь, Брэндон К .; Мартинес-Гарсия, Мануэль; Престон, Кристина М .; Щирба, Александр; Войке, Таня; Лами, Доминик; Рейнталер, Томас; Поултон, Николь Дж.; Масланд, Э. Дашиелл П. (02 сентября 2011 г.). «Возможность хемолитоавтотрофии среди повсеместно распространенных бактериальных линий в Темном океане». Наука . 333 (6047): 1296–1300. Бибкод : 2011Sci...333.1296S . doi : 10.1126/science.1203690 . ISSN 0036-8075 . PMID 21885783 . S2CID 206533092 .   
  12. ^ Войке, Таня; Се, Гэри; Коупленд, Алекс; Гонсалес, Хосе М.; Хан, Клифф; Поцелуй, Хайналка; Пила, Джимми Х .; Сенин, Павел; Ян, Чи (23 апреля 2009 г.). «Сборка морского метагенома, по одной клетке за раз» . ПЛОС ОДИН . 4 (4): e5299. Бибкод : 2009PLoSO...4.5299W . doi : 10.1371/journal.pone.0005299 . ISSN 1932-6203 . ПВК 2668756 . PMID 19390573 .   
  13. ^ Лебедь, Брэндон К .; Таппер, Бен; Щирба, Александр; Лауро, Федерико М .; Мартинес-Гарсия, Мануэль; Гонсалес, Хосе М.; Луо, Хайвэй; Райт, Джоди Дж.; Лэндри, Закари С. (09 июля 2013 г.). «Преобладающая оптимизация генома и широтная дивергенция планктонных бактерий на поверхности океана» . Труды Национальной академии наук . 110 (28): 11463–11468. Бибкод : 2013PNAS..11011463S . doi : 10.1073/pnas.1304246110 . ISSN 0027-8424 . ПВК 3710821 . PMID 23801761 .   
  14. ^ Ринке, Кристиан; Швинтек, Патрик; Щирба, Александр; Иванова, Наталья Н.; Андерсон, Иэн Дж.; Ченг, Ян-Фанг; Дорогая, Аарон; Малфатти, Стефани; Лебедь, Брэндон К. (июль 2013 г.). «Понимание филогении и кодирующего потенциала микробной темной материи» . Природа . 499 (7459): 431–437. Бибкод : 2013Natur.499..431R . дои : 10.1038/природа12352 . ISSN 0028-0836 . PMID 23851394 .  
  15. ^ Каштан, Надав; Роггенсак, Сара Э .; Родриг, Себастьян; Томпсон, Джесси В.; Биллер, Стивен Дж.; Коу, Эллисон; Дин, Хуймин; Мартинен, Пекка; Мальмстрем, Рекс Р. (25 апреля 2014 г.). «Одноклеточная геномика выявляет сотни сосуществующих субпопуляций у диких прохлорококков». Наука . 344 (6182): 416–420. Бибкод : 2014Sci...344..416K . doi : 10.1126/science.1248575 . hdl : 1721.1/92763 . ISSN 0036-8075 . PMID 24763590 . S2CID 13659345 .   
  16. ^ Уилсон, Уильям Х; Гилг, Илана С; Монируззаман, Мохаммад; Филд, Эрин К.; Корень, Сергей; Леклер, Гэри Р.; Мартинес Мартинес, Хоакин; Поултон, Николь Дж.; Лебедь, Брэндон К. (12 мая 2017 г.). «Геномное исследование отдельных гигантских океанских вирусов» . Журнал ИСМЕ . 11 (8): 1736–1745. doi : 10.1038/ismej.2017.61 . ISSN 1751-7362 . ПМС 5520044 . PMID 28498373 .   
  17. ^ Степанаускас, Рамунас; Фергюссон, Элизабет А.; Браун, Джозеф; Поултон, Николь Дж.; Таппер, Бен; Лабонте, Джессика М .; Бекрафт, Эрик Д.; Браун, Джулия М .; Пачиадаки, Мария Г. (20 июля 2017 г.). «Улучшенное восстановление генома и интегрированный анализ размеров клеток отдельных некультивируемых микробных клеток и вирусных частиц» . Связь с природой . 8 (1): 84. Бибкод : 2017NatCo...8...84S . doi : 10.1038/s41467-017-00128-z . ISSN 2041-1723 . ПВК 5519541 . PMID 28729688 .   
  18. ^ Пачиадаки, Мария Г.; Синтес, Ева; Бергауэр, Кристин; Браун, Джулия М .; Рекорд, Николас Р.; Лебедь, Брэндон К .; Мэтьер, Мэри Элизабет; Халлам, Стивен Дж.; Лопес-Гарсия, Purificacion (24 ноября 2017 г.). «Основная роль нитрит-окисляющих бактерий в фиксации углерода темного океана» . Наука . 358 (6366): 1046–1051. Бибкод : 2017Sci...358.1046P . doi : 10.1126/science.aan8260 . ISSN 0036-8075 . PMID 29170234 .  
  19. ^ Коскун; Алсмади, О (2007). «Амплификация всего генома из одной клетки: новая эра преимплантационной генетической диагностики». Пренатальная диагностика . 27 (4): 297–302. doi : 10.1002/pd.1667 . PMID 17278176 . S2CID 22175397 .  
  20. ^ Шоаиб; Бэконне, С; Мехольд, У; Ле Кам, Э; Липински, М; Огрызко, В (2008). «Многократная амплификация замещения сложных смесей фрагментов ДНК» . Геномика БМС . 9 : 415. doi : 10.1186/1471-2164-9-415 . ПВК 2553422 . PMID 18793430 .  
Получено с https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Multiple_displacement_amplification&oldid=1060767705 "
Contribute a better translation