Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Пептидный микрочип
Другие названияПептидный чип, пептидный массив
ИспользуетИзучить связывающие свойства, специфичность и функциональность, а также кинетику белок-пептидных или белок-белковых взаимодействий.

Пептид микрочип (также известный как пептидной чип или пептидный эпитоп микрочип) представляет собой набор пептидов отображаются на твердую поверхность, как правило, из стекла или пластикового чип. Пептидные чипы используются учеными в области биологии, медицины и фармакологии для изучения связывающих свойств, функциональности и кинетики белок-белковых взаимодействий в целом. В фундаментальных исследованиях пептидные микроматрицы часто используются для профилирования фермента (например, киназы , фосфатазы , протеазы , ацетилтрансферазы , гистондеацетилазы и т. Д.), Чтобы картировать эпитоп антитела.или найти ключевые остатки для связывания с белками. Практическое применение - открытие серомаркеров , профилирование изменяющихся гуморальных иммунных ответов отдельных пациентов во время прогрессирования заболевания, мониторинг терапевтических вмешательств, стратификация пациентов и разработка диагностических инструментов и вакцин .

Пример пептидного массива, используемого для идентификации эпитопа и картирования специфичности. [1]

Принцип [ править ]

Принцип анализа пептидных микрочипов аналогичен протоколу ELISA . Пептиды (до десятков тысяч в нескольких копиях) связаны с поверхностью стеклянного чипа, который обычно имеет размер и форму предметного стекла микроскопа. Этот пептидный чип можно напрямую инкубировать с множеством различных биологических образцов, таких как очищенные ферменты или антитела , сыворотки пациентов или животных , лизаты клеток.и затем обнаруживаться с помощью зависимого от метки способа, например, с помощью первичного антитела, которое нацелено на связанный белок или модифицированные субстраты. После нескольких этапов промывки наносится вторичное антитело с необходимой специфичностью (например, анти-IgG человека / мыши, или антифосфотирозин, или анти-myc). Обычно вторичное антитело маркируется флуоресцентной меткой, которую можно обнаружить с помощью флуоресцентного сканера. [2] Другие методы обнаружения, зависящие от метки, включают хемилюминесценцию, колориметрию или авторадиографию.

Анализы, зависящие от метки, быстрые и удобные для выполнения, но могут привести к ложноположительным и отрицательным результатам. [3] В последнее время безметочное обнаружение, включая спектроскопию поверхностного плазмонного резонанса (ППР), масс-спектрометрию (МС) и многие другие оптические биосенсоры [4] [5] [6] [7] , использовались для измерения широкого диапазона ферментативная активность. [8]

Пептидные микроматрицы демонстрируют несколько преимуществ перед белковыми микрочипами :

  • Легкость и стоимость синтеза
  • Повышенная стабильность при хранении
  • Обнаружение событий связывания на уровне эпитопа, что позволяет изучить распространение эпитопа.
  • Гибкий дизайн пептидной последовательности (т.е. посттрансляционные модификации, разнообразие последовательностей, неприродные аминокислоты ...) и химический состав иммобилизации
  • Более высокая воспроизводимость от партии к партии

Производство пептидного микрочипа [ править ]

Пептидная микроматрица представляет собой плоское предметное стекло с нанесенными на него пептидами или собранными непосредственно на поверхности путем синтеза in situ. В то время как выделенные пептиды могут подвергаться контролю качества, который включает масс-спектрометрический анализ и нормализацию концентрации перед нанесением пятен и является результатом одной синтетической партии, пептиды, синтезированные непосредственно на поверхности, могут страдать от вариаций от партии к партии и ограниченных возможностей контроля качества. Однако синтез пептидов на чипе позволяет параллельный синтез десятков тысяч пептидов, обеспечивая большие библиотеки пептидов в сочетании с более низкими затратами на синтез. [9]Пептиды в идеале ковалентно связаны хемоселективной связью, приводящей к пептидам с той же ориентацией для профилирования взаимодействия. Некоторые альтернативные процедуры описывают неспецифическое ковалентное связывание и иммобилизацию адгезива.

Однако литографические методы могут использоваться для решения проблемы чрезмерного количества циклов соединения. Комбинаторный синтез пептидных массивов на микрочипе с помощью лазерной печати был описан [9] [10], где модифицированный цветной лазерный принтер используется в сочетании с традиционной химией твердофазного синтеза пептидов . [11]Аминокислоты иммобилизуются в частицах тонера, а пептиды печатаются на поверхности чипа последовательными комбинаторными слоями. Плавление тонера в начале реакции сочетания гарантирует, что доставка аминокислот и реакция сочетания могут выполняться независимо. Еще одно преимущество этого метода заключается в том, что каждую аминокислоту можно производить и очищать отдельно, а затем встраивать ее в частицы тонера, что позволяет длительное время хранить.

Применение пептидных микрочипов [ править ]

Пептидные микрочипы можно использовать для изучения различных видов белок-белковых взаимодействий, особенно тех, которые включают модульные белковые субструктуры, называемые модулями распознавания пептидов или, как правило, доменами взаимодействия белков. Причина этого заключается в том, что такие белковые субструктуры распознают короткие линейные мотивы, часто экспонированные в изначально неструктурированных областях связывающего партнера, так что взаимодействие можно моделировать in vitro с помощью пептидов в качестве зондов и модуля распознавания пептидов в качестве аналита. Большинство публикаций можно найти в контексте иммунного мониторинга и профилирования ферментов.

Иммунология [ править ]

  • Картирование иммунодоминантных областей в антигенах или целых протеомах [12] [13] [14] [15]
  • Открытие серомаркеров [16]
  • Мониторинг клинических исследований [17]
  • Профилирование сигнатур антител [18] [19] и картирование эпитопов
  • Обнаружение нейтрализующих антител [20]

Профилирование ферментов [ править ]

  • Идентификация субстратов для орфанных ферментов [21]
  • Оптимизация известных ферментных субстратов [22]
  • Выяснение путей передачи сигнала [23]
  • Обнаружение активности загрязняющих ферментов
  • Определение согласованной последовательности и ключевых остатков [24]
  • Определение сайтов белок-белковых взаимодействий в комплексе [25]

Анализ и оценка результатов [ править ]

Анализ данных и оценка результатов - самая важная часть каждого эксперимента с микрочипами. [26]После сканирования слайдов микрочипа сканер записывает 20-битное, 16-битное или 8-битное числовое изображение в формате файла изображения с тегами (* .tif). Изображение .tif позволяет интерпретировать и количественно определять каждое флуоресцентное пятно на отсканированном слайде микроматрицы. Эти количественные данные являются основой для выполнения статистического анализа измеренных событий связывания или модификаций пептидов на предметном стекле микроматрицы. Для оценки и интерпретации обнаруженных сигналов необходимо выполнить выделение пептидного пятна (видимого на изображении) и соответствующей пептидной последовательности. Данные для распределения обычно сохраняются в файле GenePix Array List (.gal) и поставляются вместе с пептидным микрочипом. .Gal-файл (текстовый файл, разделенный табуляцией) может быть открыт с помощью программных модулей количественного анализа микрочипов или обработан с помощью текстового редактора (например,блокнот) или Microsoft Excel. Этот файл "gal" чаще всего предоставляется производителем микрочипов и создается с помощью входных текстовых файлов и программного обеспечения для отслеживания, встроенного в роботов, которые производят микрочипы.

Ссылки [ править ]

  1. ^ Хансен, Лайла Бранце; Буус, Сорен; Шафер-Нильсен, Клаус (23.07.2013). «Идентификация и картирование линейных эпитопов антител в сывороточном альбумине человека с использованием массивов пептидов высокой плотности» . PLOS ONE . 8 (7): e68902. Bibcode : 2013PLoSO ... 868902H . DOI : 10.1371 / journal.pone.0068902 . ISSN  1932-6203 . PMC  3720873 . PMID  23894373 .
  2. ^ Panse, S; Донг, L; Буриан, А; Carus, R; Schutkowski, M; Reimer, U; Шнайдер-Мергенер, J (2004). «Профилирование общих антифосфопептидных антител и киназ с пептидными микрочипами с использованием радиоактивных и флуоресцентных анализов». Молекулярное разнообразие . 8 (3): 291–9. DOI : 10,1023 / Б: MODI.0000036240.39384.eb . PMID 15384422 . 
  3. ^ Kaeberlein, Мэтт; МакДонах, Томас; Хельтвег, Биргит; Хиксон, Джеффри; Вестман, Эрик А .; Caldwell, Seth D .; Наппер, Эндрю; Кертис, Рори; ДиСтефано, Питер С. (29 апреля 2005 г.). «Субстрат-специфическая активация сиртуинов ресвератролом» . Журнал биологической химии . 280 (17): 17038–17045. DOI : 10.1074 / jbc.M500655200 . ISSN 0021-9258 . PMID 15684413 .  
  4. ^ Фернандес Гавела, Адриан; Грахалес Гарсия, Даниэль; Рамирес, Jhonattan C .; Лечуга, Лаура М. (24.02.2016). «Последние достижения в области кремниевых оптических биосенсоров» . Датчики . 16 (3): 285. DOI : 10,3390 / s16030285 . PMC 4813860 . PMID 26927105 .   CS1 maint: обескураженный параметр ( ссылка )
  5. Перейти ↑ Fang, Ye (2010). «Резонансный волноводный решетчатый биосенсор для микрочипов». Оптические волноводные химические и биосенсоры II . Серия Springer по химическим сенсорам и биосенсорам. 8 . Шпрингер, Берлин, Гейдельберг. С. 27–42. DOI : 10.1007 / 978-3-642-02827-4_2 . ISBN 9783642028267.
  6. ^ Пико, Сара; Филиппакопулос, Панагис (17 августа 2015 г.). «Определение зависимых от ацетил-лизина взаимодействий» . Микроматрицы . 4 (3): 370–388. DOI : 10.3390 / микрочипы4030370 . PMC 4996381 . PMID 27600229 .  
  7. ^ Хундсбергер, Харальд; Ондер, Камил; Шуллер-Гетцбург, Питер; Вирок, Дезо П .; Герцог, Юлия; Рид, Рафаэла (2017-06-08). «Сборка и использование рекомбинантных пептидных чипов высокой плотности для крупномасштабного скрининга лигандов является практической альтернативой синтетическим пептидным библиотекам» . BMC Genomics . 18 (1): 450. DOI : 10,1186 / s12864-017-3814-3 . ISSN 1471-2164 . PMC 5463365 . PMID 28595602 .   
  8. ^ Szymczak, Lindsey C .; Куо, Синь-Ю; Мрксич, Милан (02.01.2018). «Пептидные массивы: разработка и применение» . Аналитическая химия . 90 (1): 266–282. DOI : 10.1021 / acs.analchem.7b04380 . ISSN 0003-2700 . PMC 6526727 . PMID 29135227 .   
  9. ^ а б Бейер, М; Нестеров А; Блок, Я; König, K; Фельгенгауэр, Т; Фернандес, S; Лейбе, К; Торральба, G; Хаусманн, М; Багажник, U; Lindenstruth, V; Бишофф, Франция; Стадлер, В; Breitling, F (21 декабря 2007 г.). «Комбинаторный синтез пептидных массивов на микрочипе». Наука . 318 (5858): 1888. Bibcode : 2007Sci ... 318.1888B . DOI : 10.1126 / science.1149751 . PMID 18096799 . 
  10. ^ Breitling, Франк; Фельгенгауэр, Томас; Нестеров Александр; Lindenstruth, Volker; Стадлер, Фолькер; Бишофф, Ф. Ральф (23 марта 2009 г.). «Синтез пептидных массивов на основе частиц». ChemBioChem . 10 (5): 803–808. DOI : 10.1002 / cbic.200800735 . ISSN 1439-7633 . PMID 19191248 .  
  11. ^ Стадлер, Фолькер; Фельгенгауэр, Томас; Бейер, Марио; Фернандес, Саймон; Лейбе, Клаус; Гюттлер, Стефан; Грёнинг, Мартин; Кениг, Кай; Торральба, Глория (01.09.2008). «Комбинаторный синтез пептидных массивов с помощью лазерного принтера». Angewandte Chemie International Edition . 47 (37): 7132–7135. DOI : 10.1002 / anie.200801616 . ISSN 1521-3773 . PMID 18671222 .  
  12. ^ Zandian, Arash; Форсстрём, Бьёрн; Хеггмарк-Монберг, Анна; Schwenk, Jochen M .; Улен, Матиас; Нильссон, Питер; Айоглу, Бурджу (9 февраля 2017 г.). «Микромассивы цельнопротеомных пептидов для профилирования репертуаров аутоантител при рассеянном склерозе и нарколепсии» . Журнал протеомных исследований . 16 (3): 1300–1314. DOI : 10.1021 / acs.jproteome.6b00916 . PMID 28121444 . 
  13. ^ Лин, Цзин; Бардина, Людмила; Шреффлер, Уэйн Дж .; Andreae, Doerthe A .; Ге, Юнчао; Ван, Джули; Bruni, Francesca M .; Фу, Чжиян; и другие. (2009). «Разработка нового пептидного микрочипа для крупномасштабного картирования эпитопов пищевых аллергенов» . Журнал аллергии и клинической иммунологии . 124 (2): 315–22, 322.e1–3. DOI : 10.1016 / j.jaci.2009.05.024 . PMC 2757036 . PMID 19577281 .  
  14. ^ Линнебахер, М; Lorenz, P; Кой, C; Янке, А; Родился, N; Стейнбек, Ф; Воллболд, Дж; Latzkow, T; и другие. (2012). «Характеристика клональности природных эпитоп-специфических антител против родственного опухоли антигена топоизомеразы IIa с помощью пептидного чипа и протеомного анализа: пилотное исследование с образцами пациентов с колоректальной карциномой». Аналитическая и биоаналитическая химия . 403 (1): 227–38. DOI : 10.1007 / s00216-012-5781-5 . PMID 22349330 . 
  15. ^ Jaenisch, Томас; Хайсс, Кирстен; Фишер, Нико; Гейгер, Кэролин; Бишофф, Ф. Ральф; Молденхауэр, Герхард; Рыхлевский, Лешек; Сиэ, Али; Кулибали, Бубакар (апрель 2019 г.). «Пептидные массивы высокой плотности помогают идентифицировать линейные иммуногенные эпитопы B-клеток у людей, естественно подвергшихся малярийной инфекции» . Молекулярная и клеточная протеомика . 18 (4): 642–656. DOI : 10.1074 / mcp.RA118.000992 . ISSN 1535-9484 . PMC 6442360 . PMID 30630936 .   
  16. Перейти ↑ Callaway, Ewen (2011). «Появляются ключи к объяснению первого успешного испытания вакцины против ВИЧ». Природа . DOI : 10.1038 / news.2011.541 .
  17. ^ Гаррен, H; Робинсон, WH; Krasulová, E; Havrdová, E; Надж, С; Сельмадж, К; Лоси, Дж; Надж, я; и другие. (2008). «Испытание фазы 2 ДНК-вакцины, кодирующей основной белок миелина, от рассеянного склероза». Анналы неврологии . 63 (5): 611–20. CiteSeerX 10.1.1.418.3083 . DOI : 10.1002 / ana.21370 . PMID 18481290 .  
  18. ^ Gaseitsiwe, S .; Валентини, Д .; Mahdavifar, S .; Reilly, M .; Ehrnst, A .; Мейрер, М. (2009). «Идентификация на основе пептидных микрочипов связывания эпитопа Mycobacterium tuberculosis с HLA-DRB1 * 0101, DRB1 * 1501 и DRB1 * 0401» . Клиническая и вакцинная иммунология . 17 (1): 168–75. DOI : 10,1128 / CVI.00208-09 . PMC 2812096 . PMID 19864486 .  
  19. ^ Вебер, Лаура К .; Палермо, Андреа; Кюглер, Йонас; Арман, Оливье; Иссе, Авале; Рентшлер, Симона; Яениш, Томас; Хуббух, Юрген; Дюбель, Стефан (апрель 2017 г.). «Отпечаток одной аминокислоты из репертуара человеческих антител с помощью массивов пептидов высокой плотности». Журнал иммунологических методов . 443 : 45–54. DOI : 10.1016 / j.jim.2017.01.012 . ISSN 1872-7905 . PMID 28167275 .  
  20. ^ Tomaras, GD; Бинли, Дж. М.; Серый, ES; Crooks, ET; Осава, К; Мур, штат Пенсильвания; Тумба, N; Тонг, Т; и другие. (2011). «Поликлональные В-клеточные ответы на консервативные нейтрализующие эпитопы в подгруппе ВИЧ-1-инфицированных людей» . Журнал вирусологии . 85 (21): 11502–19. DOI : 10,1128 / JVI.05363-11 . PMC 3194956 . PMID 21849452 .  
  21. ^ Киндрачук, J; Арсено, Р. Кусалик, Т; Киндрачук, КН; Трост, В; Наппер, S; Ярлинг, ПБ; Блейни, Дж. Э. (2011). «Системная киномика демонстрирует, что инфекция вируса оспы обезьян бассейна Конго избирательно модулирует сигнальные реакции клетки-хозяина по сравнению с вирусом оспы обезьян в Западной Африке» . Молекулярная и клеточная протеомика . 11 (6): M111.015701. DOI : 10.1074 / mcp.M111.015701 . PMC 3433897 . PMID 22205724 .  
  22. ^ Лискано, JM; Deak, M; Моррис, N; Килох, А; Хасти, CJ; Донг, L; Schutkowski, M; Reimer, U; Алесси, Д.Р. (2002). «Молекулярная основа субстратной специфичности NIMA-родственной киназы-6 (NEK6). ДОКАЗАТЕЛЬСТВО ЧТО NEK6 НЕ ФОСФОРИЛИРУЕТ ГИДРОФОБНЫЙ МОТИФ РИБОСОМНОЙ ПРОТЕИНКИНАЗЫ S6 И СЫВОРОТКОВЫЙ И ГЛЮКОКОРТИКОИД-ИНДУЦИРУЕМЫЙ В ПРОТЕИНКИНАЗЕ» . Журнал биологической химии . 277 (31): 27839–49. DOI : 10.1074 / jbc.M202042200 . PMID 12023960 . 
  23. ^ Дельгадо, JY; Coba, M .; Андерсон, КПГ; Томпсон, КР; Серый, EE; Heusner, CL; Мартин, KC; Грант, SGN; О'Делл, Т.Дж. (2007). «Активация рецептора NMDA дефосфорилирует субъединицы рецептора глутамата 1 рецептора AMPA по треонину 840» . Журнал неврологии . 27 (48): 13210–21. DOI : 10.1523 / JNEUROSCI.3056-07.2007 . PMC 2851143 . PMID 18045915 .  
  24. ^ Тиле, А; Кренцлин, К; Erdmann, F; Раух, Д; Хауз, G; Zerweck, J; Килка, S; Pösel, S; и другие. (2011). «Парвулин 17 способствует сборке микротрубочек за счет своей пептидил-пролил цис / транс-изомеразной активности». Журнал молекулярной биологии . 411 (4): 896–909. DOI : 10.1016 / j.jmb.2011.06.040 . PMID 21756916 . 
  25. ^ Парсонс, LS; Вилкенс, S (2012). «Исследование субъединица-субъединица взаимодействий в дрожжевой вакуолярной АТФазе с помощью пептидных массивов» . PLoS ONE . 7 (10): e46960. Bibcode : 2012PLoSO ... 746960P . DOI : 10.1371 / journal.pone.0046960 . PMC 3470569 . PMID 23071676 .  
  26. ^ Хеккер, М; Lorenz, P; Стейнбек, Ф; Hong, L; Riemekasten, G; Ли, У; Зеттл, Великобритания; Тизен, HJ (2012). «Вычислительный анализ данных микроматрицы пептидов высокой плотности с применением от системного склероза до рассеянного склероза». Обзоры аутоиммунитета . 11 (3): 180–90. DOI : 10.1016 / j.autrev.2011.05.010 . PMID 21621003 .