Из Википедии, бесплатной энциклопедии
  (Перенаправлено из усиления Rolling circle )
Перейти к навигации Перейти к поиску
Репликация по вращающемуся кругу создает несколько копий одного круглого шаблона.

Подвижной круг репликации ( RCA ) представляет собой процесс однонаправленного нуклеиновой кислоты репликации , которые могут быстро синтезировать несколько копий кольцевых молекул ДНК или РНК , таких как плазмиды , в геномы из бактериофагов , и круговой РНК генома вироидов . Некоторые эукариотические вирусы также реплицируют свою ДНК или РНК по механизму катящегося круга.

В качестве упрощенной версии естественной репликации по катящемуся кругу был разработан метод изотермической амплификации ДНК, амплификация по катящемуся кругу. Механизм RCA широко используется в молекулярной биологии и биомедицинской нанотехнологии , особенно в области биосенсинга (как метод усиления сигнала). [1]

Циркулярная репликация ДНК [ править ]

Иллюстрация репликации катящегося круга.

Репликация ДНК по катящемуся кругу инициируется белком-инициатором, кодируемым плазмидой или ДНК бактериофага, который разрывает одну цепь двухцепочечной кольцевой молекулы ДНК в месте, называемом двухцепочечным ориджином, или DSO. Белок-инициатор остается связанным с 5'-фосфатным концом разорванной цепи, а свободный 3'-гидроксильный конец высвобождается, чтобы служить праймером для синтеза ДНК ДНК-полимеразой III.. Используя неотмеченную цепь в качестве матрицы, репликация происходит вокруг кольцевой молекулы ДНК, вытесняя разорванную цепь как одноцепочечную ДНК. Смещение разорванной цепи осуществляется кодируемой хозяином геликазой, называемой PcrA (сокращение от сокращенной копии плазмиды) в присутствии белка инициации репликации плазмиды.

Непрерывный синтез ДНК может производить несколько одноцепочечных линейных копий исходной ДНК в непрерывной последовательности, называемой конкатемером . Эти линейные копии могут быть преобразованы в двухцепочечные кольцевые молекулы с помощью следующего процесса:

Во-первых, белок-инициатор делает еще один разрыв в ДНК, чтобы остановить синтез первой (ведущей) цепи. РНК-полимераза и ДНК-полимераза III затем реплицируют одноцепочечную исходную ДНК (SSO), образуя еще один двухцепочечный круг. ДНК-полимераза I удаляет праймер, заменяя его ДНК, а ДНК-лигаза соединяет концы, образуя еще одну молекулу двухцепочечной кольцевой ДНК.

Итак, типичная репликация катящегося круга ДНК состоит из пяти этапов: [2]

  1. Круговая дцДНК будет «разорвана».
  2. 3' - конец удлиняется с помощью „unnicked“ ДНК в качестве ведущей цепи (шаблон); 5 'конец смещен.
  3. Вытесненная ДНК представляет собой отстающую цепь и состоит из двухцепочечных с помощью ряда фрагментов Окадзаки .
  4. Репликация как «незарегистрированной», так и смещенной оцДНК.
  5. Смещенная ДНК циркулирует.

Вирусология [ править ]

Репликация вирусной ДНК [ править ]

Некоторые ДНК-вирусы реплицируют свою геномную информацию в клетках-хозяевах посредством репликации по катящемуся кругу. Например, человеческий герпесвирус-6 (HHV-6) (hibv) экспрессирует набор «ранних генов», которые, как считается, вовлечены в этот процесс. [3] Образующиеся длинные конкатемеры впоследствии расщепляются между участками pac-1 и pac-2 генома HHV-6 с помощью рибозимов, когда они упаковываются в отдельные вирионы. [4]

Модель для репликации катящегося круга HPV16.

Вирус папилломы человека-16 (ВПЧ-16) - еще один вирус, который использует скользящую репликацию для получения потомства с высокой скоростью. ВПЧ-16 инфицирует эпителиальные клетки человека и имеет двухцепочечный кольцевой геном. Во время репликации в ориджине гексамер E1 оборачивается вокруг однонитевой ДНК и перемещается в направлении от 3 'до 5'. При нормальной двунаправленной репликации два репликационных белка диссоциируют во время столкновения, но в HPV-16 считается, что гексамер E1 не диссоциирует, что приводит к непрерывной катящейся репликации. Считается, что этот механизм репликации ВПЧ может иметь физиологические последствия для интеграции вируса в хромосому хозяина и возможного развития рака шейки матки. [5]

Кроме того, геминивирустакже использует репликацию катящегося круга в качестве механизма репликации. Это вирус, ответственный за уничтожение многих основных сельскохозяйственных культур, таких как маниока, хлопок, бобовые, кукуруза, томаты и окра. Вирус имеет кольцевую одноцепочечную ДНК, которая реплицируется в клетках растения-хозяина. Весь процесс инициируется геминивирусным белком-инициатором репликации, Rep, который также отвечает за изменение среды хозяина, чтобы действовать как часть механизма репликации. Rep также поразительно похож на большинство других белков инициаторов перекатывающейся репликации эубактерий, с присутствием мотивов I, II и III на N-конце. Во время репликации по методу катящегося круга оцДНК геминивируса преобразуется в дцДНК, и Rep затем присоединяется к дцДНК в исходной последовательности TAATATTAC. После Rep, наряду с другими белками репликации,связывается с дцДНК, он образует петлю ствола, где ДНК затем расщепляется по наномерной последовательности, вызывая смещение цепи. Это смещение позволяет репликационной вилке продвигаться в направлении от 3 'до 5', что в конечном итоге дает новую цепь оцДНК и конкатамерную цепь ДНК.[6]

Промежуточные продукты репликации ДНК бактериофага Т4 включают кольцевые и разветвленные кольцевые конкатемерные структуры. [7] Эти структуры, вероятно, отражают механизм репликации катящегося круга.

Репликация вирусной РНК [ править ]

Некоторые РНК-вирусы и вироиды также реплицируют свой геном посредством репликации РНК по кругу. Для вироидов существует два альтернативных пути репликации РНК, за которыми, соответственно, следуют члены семейства Pospivirodae (асимметричная репликация) и Avsunviroidae (симметричная репликация).

Репликация по катящемуся кругу вирусной РНК

В семействе Pospiviroidae (PSTVd-like) кольцевая плюс-цепь РНК транскрибируется РНК-полимеразой хозяина в олигомерные минус-цепи, а затем олигомерные плюс-цепи. [8] Эти олигомерные плюс-цепи расщепляются РНКазой хозяина и лигируются РНК-лигазой хозяина для преобразования мономерной плюс-цепи кольцевой РНК. Это называется асимметричным путем репликации по катящемуся кругу. Вироиды семейства Avsunviroidae (ASBVd-подобные) реплицируют свой геном посредством симметричного пути репликации по катящемуся кругу. [9]В этом симметричном пути олигомерные минус-цепи сначала расщепляются и лигируются с образованием мономерных минус-цепей, а затем транскрибируются в олигомерные плюс-цепи. Эти олигомерные плюс-цепи затем отщепляются и лигируются для преобразования мономерной плюс-цепи. Симметричный путь репликации был назван потому, что как положительные, так и отрицательные цепи образуются одинаково.

Расщепление олигомерных плюс и минус цепей опосредуется саморасщепляющейся структурой рибозима в форме головки молотка, присутствующей у Avsunviroidae, но такая структура отсутствует у Pospiviroidae. [10]

Усиление катящегося круга [ править ]

Молекулярный механизм усиления катящегося круга (RCA)

Производная форма репликации по катящемуся кругу успешно использовалась для амплификации ДНК из очень небольших количеств исходного материала. [1] Этот метод усиления называется усилением по скользящему кругу (RCA). В отличие от традиционных методов амплификации ДНК, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР) , RCA - это метод изотермической амплификации нуклеиновых кислот, при котором полимераза непрерывно добавляет отдельные нуклеотиды к праймеру, отожженному к кольцевой матрице, что приводит к длинной конкатемерной оцДНК, содержащей от десятков до сотен тандемных повторов (дополняющих круговой шаблон). [11]

Для проведения реакции RCA необходимы пять важных компонентов:

  1. ДНК-полимераза
  2. Подходящий буфер, совместимый с полимеразой.
  3. Короткий праймер ДНК или РНК
  4. Круглый шаблон ДНК
  5. Дезоксинуклеотидтрифосфаты (дНТФ)
Методы обнаружения продукта RCA

Полимеразы, используемые в RCA, представляют собой экзо- ДНК-полимеразу Phi29 , Bst и Vent для амплификации ДНК и РНК-полимеразу T7 для амплификации РНК. Поскольку ДНК-полимераза Phi29 имеет лучшую процессивность и способность замещения цепей среди всех вышеупомянутых полимераз, она наиболее часто использовалась в реакциях RCA. В отличие от полимеразной цепной реакции (ПЦР), RCA можно проводить при постоянной температуре (от комнатной температуры до 65 ° C) как в свободном растворе, так и на иммобилизованных мишенях (твердофазная амплификация).

Обычно реакция RCA ДНК включает три этапа:

  1. Циркулярное лигирование матрицы, которое можно проводить посредством ферментативного лигирования, опосредованного матрицей (например, ДНК-лигаза Т4), или лигирования без матрицы с использованием специальных ДНК-лигаз (например, CircLigase).
  2. Праймер- индуцированное удлинение одноцепочечной ДНК. Для гибридизации с одним и тем же кругом можно использовать несколько праймеров. В результате может быть инициировано несколько событий амплификации, в результате чего будет получено несколько продуктов RCA («Multiprimed RCA»).
  3. Обнаружение и визуализация продуктов амплификации, которые чаще всего проводятся с помощью флуоресцентного обнаружения, с помощью флуорофор-конъюгированного dNTP, связанных с флуорофором комплементарных или флуоресцентно меченных молекулярных маяков . Помимо флуоресцентных подходов, гель-электрофорез также широко используется для обнаружения продукта RCA.

RCA производит линейную амплификацию ДНК, поскольку каждая кольцевая матрица растет с заданной скоростью в течение определенного времени. Для увеличения выхода и достижения экспоненциальной амплификации, как это делает ПЦР, было исследовано несколько подходов. Одним из них является амплификация с гиперразветвленным катящимся кругом, или HRCA, когда добавляются и удлиняются праймеры, которые отжигаются с исходными продуктами RCA. [12] Таким образом, исходный RCA создает больше шаблонов, которые можно усилить. Другой - круговая амплификация или C2CA, где продукты RCA перевариваются рестрикционным ферментом и лигируются в новые кольцевые матрицы с использованием рестрикционного олигонуклеотида, за которым следует новый цикл RCA с большим количеством кольцевых матриц для амплификации. [13]

Приложения RCA [ править ]

иллюстрация иммуно-RCA

RCA может усилить единичное событие молекулярного связывания более чем в тысячу раз, что делает его особенно полезным для обнаружения мишеней со сверхнизким содержанием. Реакции RCA могут проводиться не только в среде свободного раствора, но и на твердой поверхности, такой как стекло, микрошарики или наночастицы, микропланшеты, микрофлюидные устройства или даже бумажные полоски. Эта особенность делает его очень мощным инструментом для усиления сигналов в твердофазных иммуноанализах (например, ELISA ). Таким образом, RCA становится универсальным инструментом для усиления сигнала с широким спектром приложений в геномике, протеомике, диагностике и биодатчиках.

Иммуно-RCA [ править ]

Immuno-RCA - это метод изотермического усиления сигнала для высокоспецифичного и высокочувствительного обнаружения и количественного определения белков. Этот метод объединяет два поля: RCA, который позволяет амплификацию нуклеотидов, и иммуноанализ, в котором используются антитела, специфичные к внутриклеточным или свободным биомаркерам. В результате иммуно-RCA дает специфический усиленный сигнал (высокое отношение сигнал / шум), что делает его пригодным для обнаружения, количественной оценки и визуализации протеиновых маркеров с низким содержанием в жидкофазных иммуноанализах [14] [15] и иммуногистохимии .

Иммуно-RCA следует типичной иммуноабсорбирующей реакции в ELISA или иммуногистохимическом окрашивании тканей. [16] Детектирующие антитела, используемые в реакции иммуно-RCA, модифицируются путем присоединения олигонуклеотида оцДНК к концу тяжелых цепей. Таким образом, участок Fab (фрагмент, связывание антигена) на детектирующем антителе все еще может связываться со специфическими антигенами, а олигонуклеотид может служить праймером для реакции RCA.

Типичная процедура иммуно-RCA, опосредованная антителами, выглядит следующим образом:

Иллюстрация иммуно-rca на основе аптамера

1. Детектирующее антитело распознает конкретную белковую мишень. Это антитело также прикреплено к олигонуклеотидному праймеру.

2. Когда присутствует кольцевая ДНК, она отжигается, и праймер совпадает с комплементарной последовательностью кольцевой ДНК.

3. Комплементарная последовательность кольцевой ДНК-матрицы копируется сотни раз и остается прикрепленной к антителу.

4. Выход RCA (удлиненная оцДНК) обнаруживается флуоресцентными зондами с использованием флуоресцентного микроскопа или считывающего устройства для микропланшетов.

Иммуно-RCA на основе аптамеров [17] [ править ]

В дополнение к опосредованной антителами иммуно-RCA праймер оцДНК RCA также может быть конъюгирован с 3'-концом ДНК-аптамера. Хвост праймера можно амплифицировать путем амплификации по типу катящегося круга. Продукт можно визуализировать посредством маркировки флуоресцентного репортера. [18] Процесс показан на рисунке справа.

Другие приложения RCA [ править ]

Различные производные RCA широко использовались в области биосенсинга. Например, RCA успешно использовался для обнаружения наличия вирусной и бактериальной ДНК в клинических образцах [19] [20], что очень полезно для быстрой диагностики инфекционных заболеваний . Он также использовался в качестве метода усиления сигнала на чипе для анализа микрочипов нуклеиновых кислот (как для ДНК, так и для РНК) . [1]

В дополнение к функции амплификации в приложениях биочувствительности, метод RCA может быть применен также для создания наноструктур ДНК и гидрогелей ДНК . Продукты RCA также могут быть использованы в качестве темплатов для периодической сборки наноразмеров или белков, синтеза металлических нанопроволок [21] и образования наноостровков . [1]

См. Также [ править ]

  • Селектор-техника

Ссылки [ править ]

  1. ^ а б в г Али, М. Монсур; Ли, Фэн; Чжан, Чжицин; Чжан, Кайсян; Канг, Донг-Ку; Анкрум, Джеймс А .; Ле, X. Крис; Чжао, Вэйан (2014). «Усиление катящегося круга: универсальный инструмент для химической биологии, материаловедения и медицины». Обзоры химического общества . 43 (10): 3324–41. DOI : 10.1039 / C3CS60439J . PMID  24643375 .
  2. ^ Усиление вращающегося круга (RCA) - к новой клинической практике | Вадим Васильевич Демидов | Springer . Springer. 2016. ISBN. 9783319422244.
  3. ^ Арбакл, Джесси (2011). «Молекулярная биология латентного периода вируса герпеса-6 человека и интеграции теломер» . Микробы и инфекции . 13 (8–9): 731–741. DOI : 10.1016 / j.micinf.2011.03.006 . PMC 3130849 . PMID 21458587 .  
  4. ^ Боренштейн, Ронен; Френкель, Низа (2009). «Клонирование генома вируса герпеса человека 6A в бактериальные искусственные хромосомы и исследование промежуточных продуктов репликации ДНК» . Труды Национальной академии наук . 106 (45): 19138–19143. Bibcode : 2009PNAS..10619138B . DOI : 10.1073 / pnas.0908504106 . PMC 2767366 . PMID 19858479 .  
  5. ^ Кусумото-Мацуо, Rika; Канда, Тадахито; Кукимото, Ивао (01.01.2011). «Репликация катящегося круга ДНК вируса папилломы человека типа 16 в экстрактах эпителиальных клеток». Гены в клетки . 16 (1): 23–33. DOI : 10.1111 / j.1365-2443.2010.01458.x . ISSN 1365-2443 . PMID 21059156 .  
  6. ^ Ризви, Ирам; Чоудхури, Нирупам Рой; Тутея, Нарендра (01.02.2015). «Понимание функциональных характеристик белка инициатора репликации катящегося круга геминивируса и его взаимодействия с факторами хозяина, влияющими на репликацию вирусной ДНК». Архив вирусологии . 160 (2): 375–387. DOI : 10.1007 / s00705-014-2297-7 . ISSN 0304-8608 . PMID 25449306 .  
  7. Перейти ↑ Bernstein H, Bernstein C (июль 1973). «Круглые и разветвленные кольцевые конкатенации в качестве возможных промежуточных продуктов в репликации ДНК бактериофага Т4». J. Mol. Биол . 77 (3): 355–61. DOI : 10.1016 / 0022-2836 (73) 90443-9 . PMID 4580243 . 
  8. ^ Дарос, Хосе-Антонио; Елена, Сантьяго Ф .; Флорес, Рикардо (июнь 2006 г.). «Вироиды: нить Ариадны в лабиринте РНК» . EMBO Reports . 7 (6): 593–598. DOI : 10.1038 / sj.embor.7400706 . ISSN 1469-221X . PMC 1479586 . PMID 16741503 .   
  9. ^ Tsagris, Efthimia Mina; Мартинес де Альба, Анхель Эмилио; Гозманова, Марьяна; Калантидис, Критон (1 ноября 2008 г.). «Вироиды» . Клеточная микробиология . 10 (11): 2168–2179. DOI : 10.1111 / j.1462-5822.2008.01231.x . ISSN 1462-5822 . PMID 18764915 .  
  10. ^ Флорес, Рикардо; Газ, Мария-Евгения; Молина-Серрано, Диего; Ноалес, Мария-Анхелес; Карбонелл, Альберто; Гаго, Сельма; Де ла Пенья, Маркос; Дарос, Хосе-Антонио (14 сентября 2009 г.). "Репликация вироидов: катящиеся круги, ферменты и рибозимы" . Вирусы . 1 (2): 317–334. DOI : 10,3390 / v1020317 . PMC 3185496 . PMID 21994552 .  
  11. ^ Али, М. Монсур; Ли, Фэн; Чжан, Чжицин; Чжан, Кайсян; Канг, Донг-Ку; Анкрум, Джеймс А .; Ле, X. Крис; Чжао, Вэйан (21.05.2014). «Усиление катящегося круга: универсальный инструмент для химической биологии, материаловедения и медицины». Обзоры химического общества . 43 (10): 3324–3341. DOI : 10.1039 / c3cs60439j . ISSN 1460-4744 . PMID 24643375 .  
  12. ^ Lizardi, Пол М .; Хуан, Сяохуа; Чжу, Чжэнжун; Брей-Уорд, Патрисия; Томас, Дэвид С .; Уорд, Дэвид С. (июль 1998 г.). «Обнаружение мутаций и подсчет одиночных молекул с использованием изотермической амплификации по катящемуся кругу» . Генетика природы . 19 (3): 225–232. DOI : 10,1038 / 898 . ISSN 1546-1718 . 
  13. ^ Даль, Фредрик; Банер, Йохан; Гуллберг, Матс; Мендель-Хартвиг, Марита; Ландегрен, Ульф; Нильссон, Матс (30 марта 2004 г.). «Круговая амплификация для точного и чувствительного анализа ДНК» . Труды Национальной академии наук . 101 (13): 4548–4553. DOI : 10.1073 / pnas.0400834101 . ISSN 0027-8424 . PMID 15070755 .  
  14. ^ Швейцер, Барри; Робертс, Скотт; Гримуэйд, Брайан; Шао, Вэйпин; Ван, Миньцзюань; Фу, Цинь; Шу, Quiping; Ларош, Изабель; Чжоу, Чжимин (апрель 2002 г.). «Профилирование мультиплексных белков на микроматрицах путем амплификации по типу катящегося круга» . Природа Биотехнологии . 20 (4): 359–365. DOI : 10.1038 / nbt0402-359 . ISSN 1087-0156 . PMC 2858761 . PMID 11923841 .   
  15. ^ Чжоу, Лонг; Оу, Ли-Хуан; Чу, Ся; Шен, Го-Ли; Ю, Ру-Цинь (2007). "Аптамер на основе амплификации вращающегося круга: платформа для электрохимического обнаружения белка". Аналитическая химия . 79 (19): 7492–7500. DOI : 10.1021 / ac071059s . PMID 17722881 . 
  16. ^ Гусев, Ю .; Sparkowski, J .; Raghunathan, A .; Ferguson, H .; Montano, J .; Богдан, Н .; Schweitzer, B .; Wiltshire, S .; Кингсмор, Сан-Франциско (июль 2001 г.). «Амплификация по вращающемуся кругу: новый подход к повышению чувствительности для иммуногистохимии и проточной цитометрии» . Американский журнал патологии . 159 (1): 63–69. DOI : 10.1016 / S0002-9440 (10) 61674-4 . ISSN 0002-9440 . PMC 1850404 . PMID 11438455 .   
  17. ^ Чжао, Вэйан; Али, М. Монсур; Брук, Майкл А .; Ли, Инфу (11 августа 2008 г.). «Усиление вращающегося круга: приложения в нанотехнологиях и биодетекции с функциональными нуклеиновыми кислотами». Angewandte Chemie International Edition . 47 (34): 6330–6337. DOI : 10.1002 / anie.200705982 . ISSN 1521-3773 . PMID 18680110 .  
  18. ^ Чжоу, Лонг; Оу, Ли-Хуан; Чу, Ся; Шен, Го-Ли; Ю, Жу-Цинь (01.10.2007). "Аптамер на основе амплификации вращающегося круга: платформа для электрохимического обнаружения белка". Аналитическая химия . 79 (19): 7492–7500. DOI : 10.1021 / ac071059s . ISSN 0003-2700 . PMID 17722881 .  
  19. ^ Чен, Сяоюй; Ван, Бин; Ян, Вэнь; Конг, Фанронг; Ли, Чуанью; Сунь, Чжаоган; Джелфс, Питер; Гилберт, Гвендолин Л. (2014-05-01). «Амплификация по кругу для прямого обнаружения мутаций гена rpoB в изолятах Mycobacterium tuberculosis из клинических образцов» . Журнал клинической микробиологии . 52 (5): 1540–1548. DOI : 10.1128 / JCM.00065-14 . ISSN 0095-1137 . PMC 3993705 . PMID 24574296 .   
  20. ^ Лю, Ян; Го, Янь-Линь; Цзян, Гуан-Лу; Чжоу, Ши-Цзе; Солнце, Ци; Чен, Си; Чанг, Сю-Цзюнь; Син, Ай-Инь; Ду Фэн-Цзяо (04.06.2013). «Применение гиперразветвленной амплификации катящегося круга для прямого обнаружения микобактерий туберкулеза в клинических образцах мокроты» . PLOS One . 8 (6): e64583. Bibcode : 2013PLoSO ... 864583L . DOI : 10.1371 / journal.pone.0064583 . ISSN 1932-6203 . PMC 3672175 . PMID 23750210 .   
  21. ^ Го, Маосян; Эрнандес-Нойта, Иван; Мадабуси, Нараянан; Нильссон, Матс; Вейнгаарт, Воутер ван дер (12.02.2018). «Эффективный ДНК-ассистированный синтез трансмембранных золотых нанопроволок» . Микросистемы и нанотехнология . 4 : 17084. DOI : 10.1038 / micronano.2017.84 . ISSN 2055-7434 . 

Внешние ссылки [ править ]

  • Системы репликации ДНК, используемые с небольшими кольцевыми молекулами ДНК. Genomes 2 , T. Brown et al., В NCBI Books.
  • MicrobiologyBytes: Вироиды и вирусоиды
  • http://mcmanuslab.ucsf.edu/node/246