Трансмиссионная электронная криомикроскопия
Просвечивающая электронная криомикроскопия ( КриоТЭМ ), широко известная как крио-ЭМ , представляет собой форму криогенной электронной микроскопии , а точнее тип просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), при котором образец исследуется при криогенных температурах (обычно температурах жидкого азота ). [1] Крио-ЭМ набирает популярность в структурной биологии . [2]
Полезность просвечивающей электронной криомикроскопии связана с тем, что она позволяет наблюдать образцы, которые не были окрашены или каким-либо образом зафиксированы, показывая их в естественной среде. Это отличается от рентгеновской кристаллографии , которая требует кристаллизации образца, что может быть затруднительно, и помещения его в нефизиологическую среду, что иногда может приводить к функционально несущественным конформационным изменениям.
Достижения в технологии обнаружения электронов , в частности DDE (Direct Electron Detectors), а также более мощные программные алгоритмы визуализации позволили определять макромолекулярные структуры с разрешением, близким к атомному. [3] Изображенные макромолекулы включают вирусы , рибосомы , митохондрии , ионные каналы и ферментные комплексы. Начиная с 2018 года крио-ЭМ можно применять к структурам размером с гемоглобин (64 кДа ) [4] и с разрешением до 1,8 Å . [5]В 2019 году крио-ЭМ-структуры составляли 2,5% структур, депонированных в Банке белковых данных [ 6] , и это число продолжает расти. [7] Применением крио-ЭМ является криоэлектронная томография (крио-ЭТ), где 3D-реконструкция образца создается из наклоненных 2D-изображений.
Первоначальное обоснование CryoTEM было средством борьбы с радиационным повреждением биологических образцов. Количество радиации, необходимое для получения изображения образца в электронном микроскопе , достаточно велико, чтобы быть потенциальным источником повреждения образца для хрупких структур. Кроме того, высокий вакуум , необходимый для колонки электронного микроскопа, делает среду для образца довольно жесткой.
Проблема вакуума была частично решена введением негативных красителей , но даже с негативными красителями биологические образцы склонны к разрушению структуры при обезвоживании образца. Помещение образцов в лед при температуре ниже температуры сублимации рассматривалось ранее, но вода имеет тенденцию образовывать кристаллическую решетку с меньшей плотностью при замораживании, и это может разрушить структуру всего, что в нее встроено.
В начале 1980-х годов несколько групп, изучающих физику твердого тела, пытались получить стекловидный лед различными способами, такими как замораживание под высоким давлением или мгновенное замораживание. В основополагающей статье 1984 года группа под руководством Жака Дюбоше из Европейской лаборатории молекулярной биологии показала изображения аденовируса , погруженного в стекловидный слой воды. [8] Эта статья обычно считается началом Крио-ЭМ, и эта техника была разработана до такой степени, что стала рутинной во многих лабораториях по всему миру.
