Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

Эффективность трансформации - это эффективность, с которой клетки могут поглощать внеклеточную ДНК и экспрессировать кодируемые ею гены. Это основано на компетенции ячеек. Его можно рассчитать, разделив количество успешных трансформантов на количество ДНК, использованной во время процедуры трансформации . Трансформанты - это клетки, которые приняли ДНК (чужеродную, искусственную или модифицированную) и которые могут экспрессировать гены на введенной ДНК.

Измерение [ править ]

Эффективность трансформации следует определять в условиях избытка клеток. [1] Количество жизнеспособных клеток в препарате для реакции трансформации может составлять от 2 × 10 8 до 10 11 ; Наиболее распространенные методы получения E. coli дают около 10 10 жизнеспособных клеток за реакцию. Стандартными плазмидами, используемыми для определения эффективности трансформации Escherichia coli, являются pBR322.или другие векторы аналогичного размера или меньшего размера, такие как серия векторов pUC. Однако для определения эффективности их преобразования можно использовать разные векторы. Для трансформации можно использовать 10–100 пг ДНК, для малоэффективной трансформации может потребоваться больше ДНК (обычно уровень насыщения достигается при более чем 10 нг). [2]

После трансформации 1% и 10% клеток высевают отдельно, клетки могут быть разбавлены средой по мере необходимости для облегчения посева. Дальнейшее разбавление можно использовать для высокоэффективного преобразования.

Эффективность трансформации можно измерить в трансформантах или колониеобразующих единицах (КОЕ) на мкг использованной ДНК. Эффективность трансформации 1 × 10 8 КОЕ / мкг для небольшой плазмиды, такой как pUC19 , примерно эквивалентна 1 на 2000 молекул трансформируемой плазмиды. В E. coli теоретический предел эффективности трансформации для наиболее часто используемых плазмид будет более 1 × 10 11 КОЕ / мкг. На практике наилучший достижимый результат может составлять около 2–4 × 10 10 КОЕ / мкг для небольшой плазмиды, такой как pUC19, и значительно ниже для больших плазмид.

Факторы, влияющие на эффективность трансформации [ править ]

Отдельные клетки способны поглощать множество молекул ДНК, но присутствие нескольких плазмид не оказывает значительного влияния на возникновение успешных событий трансформации. [3] На эффективность преобразования может влиять ряд факторов: [1]

Размер плазмиды . Исследование, проведенное на E. coli, показало, что эффективность трансформации линейно снижается с увеличением размера плазмиды , т.е. более крупные плазмиды трансформируются хуже, чем более мелкие. [3]

Формы ДНК - суперспиральные плазмиды имеют немного лучшую эффективность трансформации, чем релаксированные плазмиды - релаксированные плазмиды трансформируются примерно с 75% эффективностью суперспиральных плазмид. [3] Линейная и одноцепочечная ДНК имеют гораздо более низкую эффективность трансформации. Одноцепочечные ДНК трансформируют в 10 4 ниже , чем эффективность двухцепочечных них.

Генотип клеток - штаммы клонирования могут содержать мутации, улучшающие эффективность трансформации клеток. Например, штаммы E. coli K12 с мутацией deoR , первоначально обнаруженные как придающие клетке способность расти в минимальной среде с использованием инозина в качестве единственного источника углерода, имеют в 4-5 раз большую эффективность трансформации, чем аналогичные штаммы без нее. Для линейной ДНК, которая плохо трансформируется в E. coli , мутация recBC или recD может значительно повысить эффективность ее трансформации.

Рост клеток - клетки E. coli более восприимчивы к тому, чтобы стать компетентными, когда они быстро растут, поэтому клетки обычно собирают на ранней логарифмической фазе роста клеток при получении компетентных клеток. Оптимальная оптическая плотность для сбора клеток обычно составляет около 0,4, хотя она может варьироваться в зависимости от клеточного штамма. Было обнаружено, что более высокое значение 0,94–0,95 дает хороший выход компетентных клеток, но это может быть непрактичным при быстром росте клеток. [4]

Методы трансформации - способ приготовления компетентных клеток, продолжительность теплового шока, температура теплового шока, время инкубации после теплового шока, используемая питательная среда и различные добавки - все это может повлиять на эффективность трансформации клеток. Присутствие загрязняющих веществ, а также лигазы в смеси для лигирования может снизить эффективность трансформации при электропорации [5], а для электропорации может потребоваться инактивация лигазы или хлороформной экстракции ДНК, в качестве альтернативы используйте только десятую часть смеси для лигирования, чтобы уменьшить количество загрязняющих веществ. Нормальный препарат компетентных клеток может дать эффективность трансформации от 10 6 до 10 8.КОЕ / мкг ДНК. Однако существуют протоколы химического метода для создания суперкомпетентных клеток, эффективность трансформации которых может превышать 1 x 10 9 . [6] Метод электропорации в целом имеет лучшую эффективность трансформации, чем химические методы с возможным размером ДНК более 1 x 10 10 КОЕ / мкг, и он позволяет трансформировать большие плазмиды размером 200 т.п.н.

Повреждение ДНК. Воздействие УФ-излучения на ДНК в стандартной препаративной процедуре электрофореза в агарозном геле в течение всего 45 секунд может повредить ДНК, а это может значительно снизить эффективность трансформации. [7] Однако добавление цитидина или гуанозина в буфер для электрофореза в концентрации 1 мМ может защитить ДНК от повреждений. УФ-излучение с более высокой длиной волны (365 нм), которое вызывает меньшее повреждение ДНК, следует использовать, если это необходимо для работы с ДНК на УФ-трансиллюминаторе в течение длительного периода времени. Это более длинноволновое УФ-излучение вызывает более слабую флуоресценцию бромида этидия.интеркалированы в ДНК, поэтому, если необходимо получить изображения полос ДНК, можно использовать УФ-излучение с более короткой длиной волны (302 или 312 нм). Однако такое воздействие должно быть ограничено очень коротким временем, если ДНК нужно восстановить позже для лигирования и трансформации.

См. Также [ править ]

Ссылки [ править ]

  1. ^ a b Hanahan, D .; Jessee, J .; Блум, FR (1991). «Плазмидная трансформация Escherichia coli и других бактерий». Методы в энзимологии . 204 : 63–113. DOI : 10.1016 / 0076-6879 (91) 04006-A . ISBN 9780121821050. PMID  1943786 .
  2. ^ «Расчет эффективности преобразования» . Сигма-Олдрич .
  3. ^ a b c Ханахан Д. (1983). «Исследования по трансформации Escherichia coli плазмидами». J. Mol. Биол . 166 (4): 557–580. DOI : 10.1016 / S0022-2836 (83) 80284-8 . PMID 6345791 . 
  4. ^ Тан, X .; Nakata, Y .; Ли, HO; Zhang, M .; Gao, H .; Fujita, A .; Sakatsume, O .; Охта, Т .; Йокояма, К. (1994). «Оптимизация препаратов компетентных клеток для трансформации кишечной палочки» . Исследования нуклеиновых кислот . 22 (14): 2857–2858. DOI : 10.1093 / NAR / 22.14.2857 . PMC 308259 . PMID 8052542 .  
  5. ^ Имер, С. (1991). «Тепловая инактивация ДНК-лигазы перед электропорацией увеличивает эффективность трансформации» . Исследования нуклеиновых кислот . 19 (24): 6960. DOI : 10,1093 / NAR / 19.24.6960 . PMC 329344 . PMID 1762931 .  
  6. ^ Иноуэ, H .; Nojima, H .; Окаяма, Х. (1990). «Высокоэффективная трансформация Escherichia coli плазмидами». Джин . 96 (1): 23–28. DOI : 10.1016 / 0378-1119 (90) 90336-P . PMID 2265755 . 
  7. ^ Gründemann D, Schömig Е. (1996). «Защита ДНК во время препаративного электрофореза в агарозном геле от повреждений, вызванных ультрафиолетом» (PDF) . Биотехнологии . 21 (5): 898–903. DOI : 10.2144 / 96215rr02 . PMID 8922632 .  

Внешние ссылки [ править ]

  • Калькулятор эффективности трансформации бактерий