Из Википедии, свободной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

Секвенирование вставкой транспозона ( Tn-seq ) сочетает в себе мутагенез вставки транспозона с массивно-параллельным секвенированием (MPS) сайтов вставки транспозона для идентификации генов, вносящих вклад в интересующую функцию у бактерий . Первоначально метод был разработан в результате одновременной работы в четырех лабораториях под аббревиатурами HITS, [1] INSeq, [2] TraDIS, [3] и Tn-Seq. [4] Впоследствии были разработаны и применены к различным биологическим системам многочисленные вариации. В совокупности эти методы часто называют Tn-Seq, так как все они включают мониторинг приспособленности мутантов со вставкой транспозона с помощью подходов к секвенированию ДНК.[5]

Транспозоны - это строго регулируемые дискретные сегменты ДНК, которые могут перемещаться в пределах генома. Они универсальны и встречаются у Eubacteria , Archaea и Eukarya , включая человека. Транспозоны имеют большое влияние на экспрессию генов и могут использоваться для определения функции генов. Фактически, когда транспозон внедряется в ген, функция гена нарушается. [6] Из-за этого свойства транспозоны манипулируют для использования в инсерционном мутагенезе. [7] Развитие секвенирования микробного генома стало крупным достижением в использовании транспозонного мутагенеза. [8] [9]Функция, на которую влияет вставка транспозона, может быть связана с нарушенным геном путем секвенирования генома для определения местоположения сайта вставки транспозона. Массовое параллельное секвенирование позволяет одновременно секвенировать сайты инсерции транспозонов в больших смесях различных мутантов. Следовательно, полногеномный анализ возможен, если транспозоны расположены по всему геному в коллекции мутантов. [5]

Секвенирование транспозонов требует создания библиотеки вставок транспозонов, которая будет содержать группу мутантов, которые вместе имеют вставки транспозонов во все несущественные гены. Библиотека выращена в интересующих экспериментальных условиях. Частота мутантов с транспозонами, встроенными в гены, необходимые для роста в условиях теста, будет уменьшаться в популяции. Для выявления утраченных мутантов геномные последовательности, прилегающие к концам транспозона, амплифицируют с помощью ПЦР.и секвенировали с помощью MPS для определения местоположения и количества каждой вставочной мутации. Важность каждого гена для роста в условиях тестирования определяется путем сравнения численности каждого мутанта до и после роста в исследуемых условиях. Tn-seq полезен как для изучения приспособленности отдельного гена, так и для взаимодействия генов [10]

Signature-tagged mutagenesis (STM) - это более старый метод, который также включает объединение мутантов со вставками транспозонов для определения важности нарушенных генов в условиях селективного роста. [11] Высокопроизводительные версии STM используют геномные микрочипы, которые менее точны и имеют более низкий динамический диапазон, чем массивно-параллельное секвенирование. [5] С изобретением секвенирования следующего поколения геномные данные становились все более доступными. Однако, несмотря на увеличение количества геномных данных, наши знания о функциях генов остаются ограничивающим фактором в нашем понимании роли генов. [12] [13] Таким образом, возникла необходимость в высокопроизводительном подходе к изучению взаимосвязей генотип-фенотип, таких как Tn-seq.

Методология [ править ]

Установка транспозона методом Tn-seq.

Секвенирование транспозонов начинается с трансдукции [ требуется уточнение ] популяций бактерий мобильными элементами [ требуется уточнение ] с использованием бактериофагов . Tn-seq [ требуется пояснение ] использует транспозон Химара I Маринера, обычный и стабильный [ требуется пояснение ] транспозон. После трансдукции ДНК расщепляется [ требуется уточнение ], а вставленная последовательность амплифицируется с помощью ПЦР . Сайты узнавания [ необходимы пояснения ] для MmeI, эндонуклеазы рестрикции типа IIS[ требуется пояснение ] , может быть введено изменением одного нуклеотида в концевых повторах [ требуется пояснение ] Маринера [ необходимо пояснение ] . [14] Он [ требуется пояснение ] расположен за 4 пары оснований до конца концевого повтора.

MmeI делает ступенчатый разрез из 2 пар оснований [ требуется уточнение ] на 20 оснований ниже [ требуется пояснение ] от сайта узнавания [ необходимо пояснение ] . [15]

Когда MmeI переваривает ДНК из библиотеки [ требуется пояснение ] мутантов со вставкой транспозона [ необходимо пояснение ] , образуется фрагментированная ДНК, включающая левый и правый транспозон и 16 пар оснований окружающей геномной ДНК. Фрагмента из 16 пар оснований достаточно, чтобы определить место встраивания транспозона в бактериальный геном. Перевязка [ требуется пояснение ] адаптера [ необходимо пояснение ] облегчается выступом на 2 основания [ требуется пояснение ] . Праймер [ требуется пояснение ]специфичные для адаптера и праймер, специфичный для транспозона, используются для амплификации последовательности с помощью ПЦР. Продукт из 120 пар оснований [ требуется разъяснение ] затем выделяют с использованием агарозного геля [ необходимо очищение ] или очистки PAGE [ необходимо очищение ] . Затем используют массовое параллельное секвенирование для определения последовательностей фланкирующих 16 пар оснований [ требуется пояснение ] . [10]

Функция гена выводится после изучения эффектов вставки на функцию гена при определенных условиях [ требуется пояснение ] .

Преимущества и недостатки [ править ]

В отличие от высокопроизводительной инсерционной дорожки посредством глубокого секвенирования (HITS) и секвенирования сайта инсерции, направленного транспозоном (TraDIS) [ требуется пояснение ] , Tn-seq специфичен для транспозона Himar I Mariner и не может применяться к другим транспозонам или инсерционным элементам. [10] Однако протокол для Tn-seq [ требуется пояснение ] требует меньше времени [ необходима ссылка ] . HITS и TraDIS [ требуется пояснение ] используют метод сдвига ДНК [ требуется пояснение ] , который производит ряд ПЦРразмеры продуктов, которые могут вызвать предпочтительную амплификацию более коротких шаблонов ДНК, чем более длинных. Tn-seq производит продукт однородного размера, что снижает вероятность смещения ПЦР. [10]

Tn-seq может использоваться как для определения пригодности отдельных генов, так и для картирования взаимодействий генов в микроорганизмах. Существующие методы для этих типов исследований зависят от уже существующих геномных микрочипов или массивов нокаутов генов, тогда как Tn-seq - нет. Использование Tn-seq массового параллельного секвенирования делает этот метод легко воспроизводимым, чувствительным и надежным. [10] [ требуется пояснение ]

Приложения [ править ]

Tn-seq оказался полезным методом для определения новых функций генов. [ требуется пояснение ] Высокочувствительный характер Tn-seq [ необходима ссылка ] может использоваться для определения взаимосвязи фенотип-генотип, которая могла быть сочтена несущественной менее чувствительными методами. Tn-seq идентифицировал важные гены и пути, которые важны для использования холестерина в Mycobacterium tuberculosis . [16]

Tn-seq был использован для изучения организации генома более высокого порядка с использованием взаимодействий генов. [ необходима цитата ] Гены функционируют как тесно связанная сеть [ необходима цитата ] . Следовательно, чтобы изучить влияние гена на фенотип , необходимо также учитывать взаимодействия генов [ необходима цитата ] . Эти генные сети могут быть изучены путем скрининга синтетической летальности и взаимодействия генов, где двойной мутант показывает неожиданное значение пригодности по сравнению с каждым отдельным мутантом [ требуется пояснение ] [ необходима ссылка ]. Tn-seq использовался для определения генетических взаимодействий между пятью запросными генами и остальной частью генома Streptococcus pneumoniae, что выявило как усугубляющие, так и ослабляющие генетические взаимодействия. [4] [ требуется пояснение ] [10]

Tn-seq, используемый в сочетании с RNA-seq, может использоваться для изучения роли некодирующих участков ДНК. [17]

Ссылки [ править ]

  1. ^ Gawronski JD, Вонг SM, Giannoukos G, Уорд DV, Акерли BJ. Отслеживание инсерционных мутантов в библиотеках с помощью глубокого секвенирования и полногеномного скрининга генов Haemophilus, необходимых в легких. Proc Natl Acad Sci USA. 2009. 106: 16422–7. DOI: 10.1073 / pnas.0906627106. Бесплатная статья PMC
  2. ^ Гудман А.Л., Макналти Н.П., Чжао Й., Лейп Д., Митра Р.Д., Лозупоне Калифорния и др. Определение генетических детерминант, необходимых для создания симбионта кишечника человека в его среде обитания. Клеточный микроб-хозяин. 2009; 6: 279–89. DOI: 10.1016 / j.chom.2009.08.003.
  3. ^ Langridge GC, Phan MD, Turner DJ, Perkins TT, Parts L, Haase J, et al. Одновременный анализ каждого гена Salmonella Typhi с использованием одного миллиона мутантов транспозонов. Genome Res. 2009. 19: 2308–16. DOI: 10.1101 / gr.097097.109.
  4. ^ a b van Opijnen T, Bodi KL, Camilli A. Tn-seq: высокопроизводительное параллельное секвенирование для изучения пригодности и генетического взаимодействия у микроорганизмов. Нат методы. 2009; 6: 767–72. DOI: 10,1038 / Nmeth.1377.
  5. ^ a b c Barquist L, Boinett CJ, Cain AK (июль 2013 г.). «Подходы к исследованию бактериальных геномов с секвенированием с вставкой транспозона» . Биология РНК . 10 (7): 1161–9. DOI : 10,4161 / rna.24765 . PMC  3849164 . PMID  23635712 .
  6. Перейти ↑ Hayes F (2003). «Стратегии на основе транспозонов для микробной функциональной геномики и протеомики». Ежегодный обзор генетики . 37 (1): 3–29. DOI : 10.1146 / annurev.genet.37.110801.142807 . PMID 14616054 . 
  7. ^ Kleckner N, Chan RK, Тая BK, Ботстайн D (октябрь 1975). «Мутагенез путем введения резистентного к лекарству элемента, несущего перевернутое повторение». Журнал молекулярной биологии . 97 (4): 561–75. DOI : 10.1016 / s0022-2836 (75) 80059-3 . PMID 1102715 . 
  8. ^ Смит В., Чжоу К.Н., Лашкари Д., Ботштейн Д., Браун П.О. (декабрь 1996 г.). «Функциональный анализ генов дрожжевой хромосомы V методом генетического отпечатка» . Наука . 274 (5295): 2069–74. Bibcode : 1996Sci ... 274.2069S . DOI : 10.1126 / science.274.5295.2069 . PMID 8953036 . 
  9. ^ Акерли BJ, Рубин EJ, Camilli A, Лампе DJ, Robertson HM, Mekalanos JJ (июль 1998). «Систематическая идентификация основных генов морским мутагенезом in vitro» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 95 (15): 8927–32. Bibcode : 1998PNAS ... 95.8927A . DOI : 10.1073 / pnas.95.15.8927 . PMC 21179 . PMID 9671781 .  
  10. ^ Б с д е е ван Opijnen T, Bodi KL, Camilli A (октябрь 2009 г.). «Tn-seq: высокопроизводительное параллельное секвенирование для изучения пригодности и генетического взаимодействия у микроорганизмов» . Методы природы . 6 (10): 767–72. DOI : 10.1038 / nmeth.1377 . PMC 2957483 . PMID 19767758 .  
  11. ↑ Mazurkiewicz P, Tang CM, Boone C, Holden DW (декабрь 2006 г.). «Сигнатурный мутагенез: мутанты со штрих-кодированием для полногеномных скринингов» . Природа Обзоры Генетики . 7 (12): 929–39. DOI : 10.1038 / nrg1984 . PMID 17139324 . 
  12. ↑ Bork P (апрель 2000 г.). «Возможности и подводные камни в анализе последовательности: 70% барьер» . Геномные исследования . 10 (4): 398–400. DOI : 10.1101 / gr.10.4.398 . PMID 10779480 . 
  13. ^ Kasif S, Штеффен M (январь 2010). «Биохимические сети: эволюция аннотации генов» . Природа Химическая биология . 6 (1): 4–5. DOI : 10.1038 / nchembio.288 . PMC 2907659 . PMID 20016491 .  
  14. ^ Goodman А.Л., Макнолти Н.П., Zhao Y, Leip D, Митра RD, Lozupone CA, Knight R, Гордон JI (сентябрь 2009). «Определение генетических детерминант, необходимых для создания симбионта кишечника человека в его среде обитания» . Клеточный хозяин и микроб . 6 (3): 279–89. DOI : 10.1016 / j.chom.2009.08.003 . PMC 2895552 . PMID 19748469 .  
  15. ^ Morgan RD, Dwinell Е.А., Bhatia Т.К., Ланг Е.М., Люйтен Ю.А. (август 2009). «Семейство MmeI: ферменты рестрикционной модификации типа II, которые используют однонитевую модификацию для защиты хозяина» . Исследования нуклеиновых кислот . 37 (15): 5208–21. DOI : 10.1093 / NAR / gkp534 . PMC 2731913 . PMID 19578066 .  
  16. ^ Griffin JE, Gawronski JD, Dejesus MA, Ioerger TR, Акерли BJ, Sassetti CM (сентябрь 2011). «Фенотипическое профилирование с высоким разрешением определяет гены, необходимые для роста микобактерий и катаболизма холестерина» . PLOS Патогены . 7 (9): e1002251. DOI : 10.1371 / journal.ppat.1002251 . PMC 3182942 . PMID 21980284 .  
  17. ^ Манн В, ван Opijnen Т, Ван - J, Оберт С, Ван Ю.Д., Картер R, МакГолдрик ди - джей, Ridout G, Camilli А, Tuomanen Е.И., JW Рош (2012). «Контроль вирулентности малых РНК в Streptococcus pneumoniae» . PLOS Патогены . 8 (7): e1002788. DOI : 10.1371 / journal.ppat.1002788 . PMC 3395615 . PMID 22807675 .