Из Википедии, свободной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

Транспозонный мутагенез или транспозиционный мутагенез - это биологический процесс, который позволяет генам переноситься в хромосому организма-хозяина , прерывая или изменяя функцию существующего гена на хромосоме и вызывая мутацию . [1] Транспозонный мутагенез намного более эффективен, чем химический мутагенез , с более высокой частотой мутаций и меньшими шансами убить организм. Другие преимущества включают возможность индуцировать мутации с единичным попаданием, возможность включения селектируемых маркеров в конструкцию штамма и возможность восстанавливать гены после мутагенеза. [2] К недостаткам можно отнести низкую частоту транспонирования в живых системах и неточность большинства систем транспонирования.

История [ править ]

Мутагенез транспозонов был впервые изучен Барбарой МакКлинток в середине 20-го века во время ее работы с кукурузой, получившей Нобелевскую премию. МакКлинток получила степень бакалавра в 1923 году в Корнельском сельскохозяйственном колледже. К 1927 году она получила степень доктора ботаники и сразу же начала работать над темой хромосом кукурузы . [3] В начале 1940-х годов Мак-Клинток изучал потомство самоопыляемых растений кукурузы, полученное в результате скрещивания с поврежденной хромосомой 9. У этих растений отсутствовали теломеры . Это исследование побудило первое открытие транспозируемого элемента , [4] и отсюда мутагенез транспозонов был использован как биологический инструмент.

Динамика [ править ]

В случае бактерий транспозиционный мутагенез обычно осуществляется посредством плазмиды, из которой извлекается транспозон и вставляется в хромосому хозяина. Обычно для этого требуется набор ферментов , в том числе транспозазу быть переведены . Транспозаза может быть экспрессирована либо на отдельной плазмиде, либо на плазмиде, содержащей ген, который необходимо интегрировать. Альтернативно, инъекция мРНК транспозазы в клетку-хозяин может вызвать трансляцию и экспрессию . [5] Ранние эксперименты по мутагенезу транспозонов основывались на бактериофагах.и конъюгативные бактериальные плазмиды для вставки последовательностей. Они были очень неспецифичными и затрудняли включение определенных генов. Более новый метод, называемый челночным мутагенезом, использует определенные клонированные гены от вида-хозяина для включения генетических элементов. [2] Другой эффективный подход - доставка транспозонов через вирусные капсиды . Это облегчает интеграцию в хромосому и долгосрочную экспрессию трансгена . [5]

Система транспозонов Tn5 [ править ]

Структура транспозона Tn5 с последовательностью вставки, фланкирующей кассету генов, в данном случае генов устойчивости к лекарственным средствам.

Система транспозонов Tn5 представляет собой модельную систему для изучения транспозиции и применения мутагенеза транспозонов. Tn5 представляет собой бактериальный композитный транспозон, в котором гены (исходная система, содержащая гены устойчивости к антибиотикам ) фланкированы двумя почти идентичными последовательностями вставки , названными IS50R и IS50L, соответствующими правой и левой сторонам транспозона соответственно. [6] Последовательность IS50R кодирует два белка, Tnp и Inh. Эти два белка идентичны по последовательности, за исключением того факта, что Inh не содержит 55 N-концевых аминокислот . Tnp кодирует транспозазу для всей системы, а Inh кодирует ингибитор транспозазы. ДНК-связывающий доменTnp находится в 55 N-концевых аминокислотах, и поэтому эти остатки необходимы для функционирования. [6] Последовательности IS50R и IS50L обе фланкированы элементами из 19 пар оснований на внутреннем и внешнем концах транспозона, обозначенными IE и OE соответственно. Мутация этих областей приводит к неспособности генов транспозаз связываться с последовательностями. Связывающие взаимодействия между транспозазой и этими последовательностями очень сложны и зависят от метилирования ДНК и других эпигенетических меток. [6] Кроме того, другие белки, по-видимому, способны связываться и влиять на транспозицию элементов IS50, таких как DnaA.

Наиболее вероятный путь транспозиции Tn 5 является общим для всех систем транспозонов. Он начинается с того, что Tnp связывает последовательности OE и IE каждой последовательности IS50. Два конца сводятся вместе, и в результате олигомеризации ДНК последовательность вырезается из хромосомы. После введения 5'-концов пары 9 оснований в ДНК-мишень транспозон и включенные в него гены вставляются в ДНК-мишень, дублируя области на любом конце транспозона. [6] Представляющие интерес гены могут быть генетически модифицированы в систему транспозонов между последовательностями IS50. Поместив транспозон под контроль промотора хозяина., гены будут выражены. Включенные гены обычно включают, помимо интересующего гена, селективный маркер для идентификации трансформантов, эукариотический промотор / терминатор (если экспрессируется в эукариотах) и последовательности 3'- UTR для разделения генов в полицистронном участке последовательности.

Система транспозонов "Спящей красавицы" [ править ]

Система транспозонов Sleeping Beauty (SBTS) - это первый успешный невирусный вектор для включения кассеты генов в геном позвоночных . Вплоть до разработки этой системы основными проблемами невирусной генной терапии было внутриклеточное разрушение трансгена из-за того, что он распознавался как прокариот.и неэффективная доставка трансгена в системы органов. SBTS произвел революцию в этих вопросах, объединив преимущества вирусов и «голой» ДНК. Он состоит из транспозона, содержащего кассету экспрессируемых генов, а также собственного фермента транспозазы. Путем транспонирования кассеты непосредственно в геном организма из плазмиды может быть достигнута устойчивая экспрессия трансгена. [2]Это может быть дополнительно уточнено путем улучшения последовательностей транспозонов и используемых ферментов транспозаз. SB100X - это гиперактивная транспозаза млекопитающих, которая примерно в 100 раз эффективнее типичной транспозазы первого поколения. Включение этого фермента в кассету приводит к еще более устойчивой экспрессии трансгена (более одного года). Кроме того, частота трансгенеза может достигать 45% при использовании пронуклеарной инъекции в зиготы мыши . [7]

Система транспозонов "Спящей красавицы". Фермент транспозаза может экспрессироваться в цис- или транс-форме по отношению к кассете гена.

Механизм SBTS аналогичен системе транспозона Tn5, однако последовательности ферментов и генов имеют эукариотическую природу, в отличие от прокариотических. Транпозаза системы может действовать как в транс, так и в цис- форме, обеспечивая разнообразный набор структур транспозонов. Сам транспозон фланкирован инвертированными повторяющимися последовательностями., каждая из которых повторяется дважды напрямую, называемые последовательностями IR / DR. Внутренняя область состоит из гена или последовательности, подлежащей транспонированию, и может также содержать ген транспозазы. Альтернативно, транспозаза может быть закодирована на отдельной плазмиде или введена в ее белковой форме. Еще один подход заключается во включении генов транспозона и транспозазы в вирусный вектор, который может нацеливаться на выбранную клетку или ткань. Белок транспозазы чрезвычайно специфичен в последовательностях, которые он связывает, и способен отличать свои последовательности IR / DR от аналогичной последовательности по трем парам оснований. Как только фермент связывается с обоими концами транспозона, последовательности IR / DR объединяются и удерживаются транспозазой в образовании синаптического комплекса (SCF). Формирование SCF является контрольной точкой, обеспечивающей правильное расщепление.HMGB1 - это негистоновый белок хозяина, связанный с эукариотическим хроматином. Он усиливает предпочтительное связывание транспозазы с последовательностями IR / DR и, вероятно, необходим для образования / стабильности комплекса SCF. Транспозаза расщепляет ДНК в целевых сайтах, образуя 3'-выступы . Затем фермент нацелен на динуклеотиды ТА в геноме хозяина в качестве сайтов-мишеней для интеграции. Тот же самый ферментативный каталитический сайт, который расщепил ДНК, отвечает за интеграцию ДНК в геном, дублируя при этом область генома. Хотя транспозаза специфична для динуклеотидов ТА, высокая частота этих пар в геноме указывает на то, что транспозон претерпевает довольно случайную интеграцию. [8]

Практическое применение [ править ]

В результате способности транспозонного мутагенеза включать гены в большинство областей целевых хромосом, с этим процессом связан ряд функций.

  • Гены вирулентности у вирусов и бактерий можно обнаружить, нарушив работу генов и наблюдая за изменением фенотипа . Это важно для производства антибиотиков и борьбы с болезнями. [4]
  • Несущественные гены можно обнаружить, индуцируя мутагенез транспозонов в организме. Преобразованные гены затем могут быть идентифицированы путем проведения ПЦРА на выделенном организм генома с использованием ORF -специфического праймера и транспозон-специфический праймера. [4] Поскольку транспозоны могут встраиваться в некодирующие области ДНК, специфический праймер ORF гарантирует, что транспозон прервал ген. Поскольку организм выжил после гомологичной интеграции , прерванный ген был явно несущественным.
  • Гены, вызывающие рак, можно идентифицировать с помощью полногеномного мутагенеза и скрининга мутантов, содержащих опухоли. Основываясь на механизме и результатах мутации, гены, вызывающие рак, могут быть идентифицированы как онкогены или гены-супрессоры опухоли . [9]

Конкретные примеры [ править ]

Идентификация кластера генов вирулентности Mycobacterium tuberculosis [ править ]

В 1999 г. гены вирулентности, связанные с Mycobacterium tuberculosis, были идентифицированы посредством нокаута гена, опосредованного мутагенезом транспозонов . Плазмида, названная pCG113, содержащая гены устойчивости к канамицину и последовательность вставки IS 1096 , была сконструирована так, чтобы она содержала вариабельные теги из 80 пар оснований. Затем плазмиды трансформировали в клетки M. tuberculosis электропорацией . Колонии высевали на канамицин для отбора устойчивых клеток. Колонии, которые подверглись случайным событиям транспозиции, были идентифицированы перевариванием Bam HI и саузерн-блоттингом с использованием внутреннего IS 1096.ДНК-зонд. Колонии проверяли на ослабленное размножение, чтобы идентифицировать колонии с мутациями в кандидатных генах вирулентности. Мутации, приводящие к ослаблению фенотипа, были картированы путем амплификации соседних областей с последовательностями IS 1096 и сравнены с опубликованным геномом M. tuberculosis . В этом случае мутагенез транспозонов идентифицировал 13 патогенных локусов в геноме M. tuberculosis, которые ранее не были связаны с заболеванием. [10] Это важная информация для понимания инфекционного цикла бактерии.

Мутагенез транспозона PiggyBac (PB) для открытия гена рака [ править ]

PiggyBac (ПБ) транспозон из совка моли Trichoplusia Ni был разработан , чтобы быть очень активным в клетках млекопитающих, и способен общегеномного мутагенеза. Транспозоны содержали инвертированные повторы как PB, так и Sleeping Beauty , чтобы распознаваться обеими транспозазами и увеличивать частоту транспозиции. Кроме того, транспозон содержал элементы промотора и энхансера , донор сплайсинга и акцепторы, позволяющие мутации с усилением или потерей функции в зависимости от ориентации транспозона, и сигналы двунаправленного полиаденилирования . Транспозоны трансформировали в клетки мыши in vitro.и были проанализированы мутанты, содержащие опухоли. Механизм мутации, приводящей к образованию опухоли, определяли, был ли ген классифицирован как онкоген или ген-супрессор опухоли. Онкогены, как правило, характеризовались вставками в области, ведущими к сверхэкспрессии гена, тогда как гены-супрессоры опухолей были классифицированы как таковые на основании мутаций потери функции. Поскольку мышь является модельным организмом для изучения физиологии человека и болезней, это исследование поможет улучшить понимание генов, вызывающих рак, и потенциальных терапевтических мишеней. [9]

См. Также [ править ]

  • Транспозоны как генетический инструмент
  • Переносной элемент
  • Транспозаза
  • Барбара МакКлинток

Ссылки [ править ]

  1. ^ "Кормление голодных ртов" . Биотехнологическая программа: Отчеты по проекту: Анализ генома . Европейская комиссия. 2001. 2-2.
  2. ^ а б в Зейферт, HS; Чен, EY; Итак, М; Хеффрон, Ф (1986-02-01). «Челночный мутагенез: метод транспозонного мутагенеза для Saccharomyces cerevisiae» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 83 (3): 735–739. Bibcode : 1986PNAS ... 83..735S . DOI : 10.1073 / pnas.83.3.735 . ISSN 0027-8424 . PMC 322939 . PMID 3003748 .   
  3. ^ Ravindran, Sandeep (2012-12-11). «Барбара МакКлинток и открытие прыгающих генов» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 109 (50): 20198–20199. DOI : 10.1073 / pnas.1219372109 . ISSN 1091-6490 . PMC 3528533 . PMID 23236127 .   
  4. ^ a b c Хамер, Лизбет; ДеЗваан, Тодд М; Черногория-Чаморро, Мария Виктория; Фрэнк, Шерил А; Хамер, Джон Э (2001-02-01). «Последние достижения в крупномасштабном мутагенезе транспозонов». Текущее мнение в химической биологии . 5 (1): 67–73. DOI : 10.1016 / S1367-5931 (00) 00162-9 . PMID 11166651 . 
  5. ^ a b Шкипер, Кристиан А .; Андерсен, Питер Р .; Шарма, Нинн; Миккельсен, Якоб Г. (2013-12-09). «Генные носители на основе транспозонов ДНК - сцены из эволюционного драйва» . Журнал биомедицинских наук . 20 (1): 92. DOI : 10,1186 / 1423-0127-20-92 . ISSN 1423-0127 . PMC 3878927 . PMID 24320156 .   
  6. ^ а б в г Резникофф, WS (1993-01-01). «Транспозон Tn5». Ежегодный обзор микробиологии . 47 : 945–963. DOI : 10.1146 / annurev.mi.47.100193.004501 . ISSN 0066-4227 . PMID 7504907 .  
  7. ^ Матес, Лайош; Чуах, Марин К.Л.; Страховка, Эяю; Джерчоу, Борис; Манодж, Намитха; Акоста-Санчес, Абель; Grzela, Dawid P; Шмитт, Андреа; Беккер, Катя (июнь 2009 г.). «Молекулярная эволюция новой гиперактивной транспозазы Спящей красавицы обеспечивает надежный и стабильный перенос генов у позвоночных». Генетика природы . 41 (6): 753–761. DOI : 10.1038 / ng.343 . PMID 19412179 . 
  8. ^ Izsvák Жужанна; Ивиц, Золтан (1 февраля 2004 г.). «Транспозиция« Спящей красавицы »: биология и применение» . Молекулярная терапия . 9 (2): 147–156. DOI : 10.1016 / j.ymthe.2003.11.009 . ISSN 1525-0016 . PMID 14759798 .  
  9. ^ а б Рад, Роланд; Рад, Лена; Ван, Вэй; Кадинанос, Хуан; Василиу, Джордж; Райс, Стивен; Campos, Lia S .; Юса, Косуке; Банерджи, Руби (19 ноября 2010 г.). «Мутагенез транспозонов PiggyBac: инструмент для открытия раковых генов у мышей» . Наука . 330 (6007): 1104–1107. Bibcode : 2010Sci ... 330.1104R . DOI : 10.1126 / science.1193004 . ISSN 0036-8075 . PMC 3719098 . PMID 20947725 .   
  10. ^ Камачо, Луис Рейнальдо; Ensergueix, Danielle; Перес, Эстер; Жикель, Бриджит; Гильо, Кристоф (1999-10-01). «Идентификация кластера генов вирулентности Mycobacterium tuberculosis с помощью сигнатурно-меченного мутагенеза транспозонов». Молекулярная микробиология . 34 (2): 257–267. DOI : 10.1046 / j.1365-2958.1999.01593.x . ISSN 1365-2958 . PMID 10564470 .  

Внешние ссылки [ править ]

  • «Прыгающие гены: от явления к инструменту» . Генная инженерия: растения: окружающая среда . GMO-Safety.eu. 21 апреля 2006 г.
  • "Transposon Mutagenisis" - Новости пищевых ингредиентов
  • Эллер Дж. Дж. (1989). «Патогенез и иммунитет при коклюше». ДЖАМА . 261 (13): 1981–2. DOI : 10,1001 / jama.1989.03420130151042 .
  • Кук У. Б., Майлз Д. (октябрь 1988 г.). «Транспозонный мутагенез ядерных фотосинтетических генов у Zea mays ». Photosyn. Res . 18 (1-2): 33-59. DOI : 10.1007 / BF00042979 . PMID  24425160 .