Из Википедии, бесплатной энциклопедии
  (Перенаправлено с Biotage )
Перейти к навигации Перейти к поиску

Пиросеквенирование - это метод секвенирования ДНК (определение порядка нуклеотидов в ДНК), основанный на принципе «секвенирования путем синтеза», при котором секвенирование выполняется путем обнаружения нуклеотида, включенного ДНК-полимеразой . Пиросеквенирование основано на обнаружении света на основе цепной реакции при высвобождении пирофосфата . Отсюда и название пиросеквенирование.

Принцип Пиросеквенирование был впервые описан в 1993 году [1] по Bertil Pettersson , Mathias Uhlen и Пал Найрен путем объединения твердофазного секвенирования метод [2] с использованием стрептавидина с покрытием магнитных шариков с рекомбинантной ДНК - полимеразы не хватает 3'to 5'exonuclease активности (доказательство -чтение) и детектирование люминесценции с помощью фермента люциферазы светлячка . [3] Смесь трех ферментов ( ДНК-полимераза , АТФ-сульфурилаза и люцифераза светлячка ) и нуклеотида ( dNTP) добавляются к одноцепочечной ДНК, подлежащей секвенированию, и за включением нуклеотида следует измерение испускаемого света. Интенсивность света определяет, были ли включены 0, 1 или более нуклеотидов, таким образом показывая, сколько комплементарных нуклеотидов присутствует на матричной цепи. Смесь нуклеотидов удаляют перед добавлением следующей смеси нуклеотидов. Этот процесс повторяется с каждым из четырех нуклеотидов до тех пор, пока не будет определена последовательность ДНК одноцепочечной матрицы.

Вторым способ решения на основе для Пиросеквенирования был описан в 1998 году [4] с помощью Мостаф Ронай , Mathias Uhlen и Пал Найрен . В этом альтернативном методе вводится дополнительный фермент апираза для удаления нуклеотидов, которые не включены в ДНК-полимеразу. Это позволило добавить смесь ферментов, включающую ДНК-полимеразу , люциферазу и апиразу, в начале и сохранить на протяжении всей процедуры, что обеспечивает простую настройку, подходящую для автоматизации. Автоматизированный прибор, основанный на этом принципе, был представлен на рынке в следующем году компанией Pyrosequencing.

Третий микрофлюидный вариант метода Пиросеквенирования был описан в 2005 году [5] от Джонатана Rothberg и сотрудников в компании 454 Life Sciences . Этот альтернативный подход к Пиросеквенированию был основан на оригинальном принципе прикрепления ДНК, подлежащие секвенированию на твердый носитель , и они показали , что последовательность может быть выполнена в высшей степени параллельно с использованием микроизготовленных микрочип . Это позволило осуществить высокопроизводительное секвенирование ДНК, и на рынке был представлен автоматизированный прибор. Это стало первым прибором для секвенирования следующего поколения, открывшим новую эру в исследованиях геномики , с быстро падающими ценами на секвенирование ДНК, что позволилосеквенирование всего генома по доступным ценам.

Процедура [ править ]

Как работает пиросеквенирование
На диаграмме показано, как работает пиросеквенирование.

«Секвенирование путем синтеза» включает взятие одной цепи ДНК для секвенирования и затем ферментативный синтез ее комплементарной цепи. Метод пиросеквенирования основан на обнаружении активности ДНК-полимеразы (фермента, синтезирующего ДНК) с другим хемолюминесцентным ферментом . По сути, этот метод позволяет секвенировать одну цепь ДНК путем синтеза комплементарной цепи вдоль нее, по одной паре оснований за раз, и определения того, какое основание было фактически добавлено на каждом этапе. Матричная ДНК неподвижна, и растворы нуклеотидов A, C, G и Tпоследовательно добавляются и удаляются из реакции. Свет возникает только тогда, когда раствор нуклеотидов дополняет первую неспаренную основу матрицы. Последовательность растворов, которые производят хемилюминесцентные сигналы, позволяет определить последовательность матрицы. [6]

Для версии пиросеквенирования на основе раствора матрица одноцепочечной ДНК ( оцДНК ) гибридизируется с праймером для секвенирования и инкубируется с ферментами ДНК-полимеразой , АТФ-сульфурилазой , люциферазой и апиразой , а также с субстратами аденозин-5´ фосфосульфатом (APS). и люциферин .

  1. Добавление одного из четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов ( dNTP ) (dATPαS, который не является субстратом для люциферазы, добавляется вместо dATP, чтобы избежать шума) запускает второй этап. ДНК-полимераза включает правильные комплементарные дНТФ в матрицу. Это включение высвобождает пирофосфат (PPi).
  2. АТФ-сульфурилаза превращает PPi в АТФ в присутствии аденозин-5´ фосфосульфата. Этот АТФ действует как субстрат для опосредованного люциферазой превращения люциферина в оксилюциферин, который генерирует видимый свет в количествах, пропорциональных количеству. Свет, образующийся в реакции, катализируемой люциферазой, регистрируется камерой и анализируется программой.
  3. Невключенные нуклеотиды и АТФ разлагаются апиразой , и реакция может возобновиться с другого нуклеотида.

Процесс можно представить следующими уравнениями:

  • PPi + APS → ATP + сульфат (катализируется АТФ-сульфурилазой);
  • АТФ + люциферин + O2 → AMP + PPi + оксилюциферин + CO2 + hv (катализируется люциферазой);

где:

  • PPi пирофосфат
  • APS представляет собой аденозин-5-фосфосульфат;
  • АТФ - аденозинтрифосфат;
  • O2 - молекула кислорода;
  • АМФ представляет собой монофосфат аденозина;
  • СО2 - двуокись углерода;
  • hv светлый.

Ограничения [ править ]

В настоящее время ограничением метода является то, что длины отдельных считываний последовательности ДНК находятся в районе 300-500 нуклеотидов, что меньше, чем 800-1000, которые можно получить с помощью методов терминации цепи (например, секвенирования по Сэнгеру). Это может затруднить процесс сборки генома , особенно для последовательностей, содержащих большое количество повторяющейся ДНК . Отсутствие корректуры ограничивает точность этого метода.

Коммерциализация [ править ]

Компания Pyrosequencing AB в Упсале, Швеция, была основана на венчурный капитал, предоставленный HealthCap, с целью коммерциализации оборудования и реагентов для секвенирования коротких участков ДНК с использованием техники пиросеквенирования. Компания Pyrosequencing AB была зарегистрирована на Стокгольмской фондовой бирже в 1999 году. В 2003 году она была переименована в Biotage . Бизнес-направление пиросеквенирования было приобретено Qiagen в 2008 году. Лицензия на технологию пиросеквенирования была передана 454 Life Sciences . 454 разработала технологию пиросеквенирования на основе массивов, которая стала платформой для крупномасштабного секвенирования ДНК , включаясеквенирование генома и метагеномика .

Компания Roche объявила о прекращении производства платформы секвенирования 454 в 2013 году, когда ее технология стала неконкурентоспособной. [7]

Ссылки [ править ]

  1. ^ Нирен, Петерссон и Улен (1993) «Минисеквенирование твердой фазы ДНК с помощью ферментативного люминометрического анализа обнаружения неорганического пирофосфата» Analytical Biochemistry 208 (1), 171-175, https://doi.org/10.1006/abio.1993.1024
  2. ^ Улен (1989) «Магнитное разделение ДНК» Nature 340: 733-4, https://doi.org/10.1038/340733a0
  3. ^ Нирен и Лундин (1985) «Ферментативный метод для непрерывного мониторинга синтеза неорганического пирофосфата» Аналитическая биохимия 151 (2): 504-509. https://doi.org/10.1016/0003-2697(85)90211-8
  4. ^ Ронаги, Улен и Найрен (1998) «Метод секвенирования, основанный на пирофосфате в реальном времени» Наука. 281 (5375): 363. https://doi.org/10.1126/science.281.5375.363 .
  5. ^ Marguiles et al (2005) «Секвенирование генома в микроизготовленных пиколитровых реакторах высокой плотности» Nature 437, 376-380. https://doi.org/doi:10.1038/nature03959 ;
  6. ^ QIAGEN. «Обзор технологии и платформы пиросеквенирования» . Проверено 4 августа 2017 года .
  7. ^ Hollmer, Марк (17 октября 2013). «Рош закроет 454 Life Sciences, поскольку это снижает фокус секвенирования генов» . Жестокая биотехнология .

Дальнейшее чтение [ править ]

  • Мецкер М. (2005). «Новые технологии в секвенировании ДНК» . Геномные исследования . 15 (12): 1767–76. DOI : 10.1101 / gr.3770505 . PMID  16339375 .