Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Бактерии Escherichia coli, которые часто используются в производстве фармацевтических продуктов.

Современные методы фармацевтического производства часто основываются на биотехнологиях .

Человеческий инсулин [ править ]

Кристаллы инсулина

Одним из первых применений биотехнологии в фармацевтическом производстве является использование технологии рекомбинантной ДНК для модификации бактерий Escherichia coli для производства человеческого инсулина , что было выполнено в Genentech в 1978 году. [1] До разработки этого метода инсулин экстрагировали из поджелудочные железы крупного рогатого скота, свиней и других сельскохозяйственных животных. Хотя в целом инсулин животного происхождения эффективен при лечении диабета , он неотличим от человеческого инсулина и поэтому может вызывать аллергические реакции. [2] Исследователи Genentech создали искусственные гены для каждого из двухбелковые цепи, составляющие молекулу инсулина. Искусственные гены были «затем вставлены ... в плазмиды ... среди группы генов, которые» [1] активируются лактозой . Таким образом, гены, продуцирующие инсулин, также активируются лактозой. Рекомбинантные плазмиды вставляли в бактерии Escherichia coli , которые «индуцировали продуцирование 100 000 молекул человеческого инсулина либо цепи А, либо цепи В». [1] Затем две белковые цепи были объединены для получения молекул инсулина.

Гормон роста человека [ править ]

Гормон роста

До использования технологии рекомбинантной ДНК для модификации бактерий для производства гормона роста человека гормон производился путем экстракции из гипофиза трупов, поскольку гормоны роста животных не имеют терапевтического значения для людей. Для производства годового запаса гормона роста человека требовалось до пятидесяти гипофизов [3], создавая значительный дефицит гормона. [4] В 1979 году ученые Genentech произвели гормон роста человека, вставив ДНК, кодирующую гормон роста человека, в плазмиду, имплантированную в бактерии Escherichia coli . Ген, который был вставлен в плазмиду, был создан путем обратной транскрипции.мРНК, обнаруженной в гипофизе, к комплементарной ДНК. HaeIII, тип рестрикционного фермента, который действует на сайтах рестрикции «в 3'-некодирующей области» [5] и на 23-м кодоне в комплементарной ДНК для гормона роста человека, был использован для получения «фрагмента ДНК из 551 пары оснований, который включает кодирующие последовательности для аминокислот 24–191 HGH ». [5] Затем был получен «химически синтезированный« адаптерный »фрагмент ДНК, содержащий инициирующий кодон ATG ...» [5] с кодонами для аминокислот с первой по 23-ю в гормоне роста человека. «Два фрагмента ДНК ... [были] объединены, чтобы сформировать синтетический природный« гибридный »ген». [5]Использование полностью синтетических методов производства ДНК для получения гена, который будет транслироваться в гормон роста человека в Escherichia coli, было бы чрезвычайно трудоемким из-за значительной длины аминокислотной последовательности в гормоне роста человека. Однако, если бы кДНК, обратно транскрибируемая с мРНК гормона роста человека, была бы вставлена ​​непосредственно в плазмиду, вставленную в кишечную палочку, бактерии транслировали бы участки гена, которые не транслируются у человека, тем самым производя «прегормон, содержащий лишние 26 аминокислот » [5], которые может быть трудно удалить.

Факторы свертывания крови человека [ править ]

До разработки и утверждения FDA средств для получения факторов свертывания крови человека с использованием технологий рекомбинантной ДНК, факторы свертывания крови человека были получены из донорской крови, которая не была должным образом проверена на ВИЧ . Таким образом, ВИЧ-инфекция представляла значительную опасность для больных гемофилией , получивших факторы свертывания крови человека:

Большинство отчетов показывают, что от 60 до 80 процентов пациентов с гемофилией, которые подвергались воздействию концентратов фактора VIII в период между 1979 и 1984 годами, являются серопозитивными на ВИЧ по данным Вестерн-блоттинга. По состоянию на май 1988 г. более 659 больных гемофилией болели СПИДом ... [6]

Первым фактором свертывания крови человека, который был произведен в значительных количествах с использованием технологии рекомбинантной ДНК, был фактор IX , который был получен с использованием трансгенных клеток яичников китайского хомячка в 1986 году. [7] Не имея карты генома человека, исследователи получили известную последовательность РНК для фактора IX путем исследования аминокислот в факторе IX:

Микросеквенирование высокоочищенного ... [фактора IX] дало аминокислотную последовательность, достаточную для конструирования олигонуклеотидных зондов. [8]

Затем известная последовательность РНК фактора IX была использована для поиска гена, кодирующего фактор IX, в библиотеке ДНК, обнаруженной в печени человека, поскольку было известно, что факторы свертывания крови продуцируются печенью человека: [8]

Уникальный олигонуклеотид ... гомологичный мРНК фактора IX ... был синтезирован и помечен ... Полученный зонд был использован для скрининга библиотеки двухцепочечной кДНК печени человека ... Полные двухцепочечные последовательности ДНК ... [релевантная] кДНК ... содержала всю кодирующую последовательность COOH-конца одиннадцатого кодона (11) и всю 3'-нетранслируемую последовательность. [7]

Эта последовательность кДНК была использована для поиска оставшихся последовательностей ДНК, содержащих ген фактора IX, путем поиска ДНК в Х-хромосоме:

Была подготовлена ​​геномная библиотека из хромосомы человека XXXX ... и проведен скрининг с помощью зонда кДНК фактора IX. Гибридизирующий рекомбинантный фаг выделяли, очищали от бляшек и выделяли ДНК. Рестрикционное картирование, Саузерн-анализ и секвенирование ДНК позволило идентифицировать пять рекомбинантных фагосодержащих вставок, которые при перекрытии в общих последовательностях кодировали весь ген фактора IX размером 35 т.п.н. [9]

Плазмиды, содержащие ген фактора IX, вместе с плазмидами с геном, кодирующим устойчивость к метотрексату, были вставлены в клетки яичников китайского хомячка посредством трансфекции. Трансфекция включает введение ДНК в эукариотическую клетку. В отличие от аналогичного процесса трансформации у бактерий, трансфицированная ДНК обычно не интегрируется в геном клетки и поэтому обычно не передается последующим поколениям через деление клетки. Таким образом, чтобы получить "стабильную" трансфекцию, необходимо также трансфицировать ген, который дает значительное преимущество в выживании, в результате чего несколько клеток, которые действительно интегрировали трансфицированную ДНК в свои геномы, увеличивают свою популяцию как клетки, которые не интегрировали ДНК. устранены. В случае этого исследования "расти [th] при увеличении концентрации метотрексата »[10] способствовали выживанию стабильно трансфицированных клеток и уменьшали выживаемость других клеток.

Клетки яичников китайского хомячка, которые были стабильно трансфицированы, продуцировали значительные количества фактора IX, который, как было показано, обладает значительными коагулянтными свойствами, хотя и в меньшей степени, чем фактор IX, продуцируемый из крови человека:

Удельная активность рекомбинантного фактора IX была измерена на основе прямого измерения коагулянтной активности ... Удельная активность рекомбинантного фактора IX составляла 75 единиц / мг ... по сравнению со 150 единицами / мг, измеренными для фактора, полученного из плазмы. IX ... [11]

В 1992 году FDA одобрило фактор VIII, полученный с использованием трансгенных клеток яичников китайского хомячка, первый такой фактор свертывания крови, полученный с использованием технологии рекомбинантной ДНК, который был одобрен. [12]

Трансгенные сельскохозяйственные животные [ править ]

Свинья, трансгенные поколения которой могут быть использованы для производства заменителей крови для людей.

Методики рекомбинантной ДНК также использовались для создания трансгенных сельскохозяйственных животных, которые могут производить фармацевтические продукты для использования на людях. Например, созданы свиньи, вырабатывающие гемоглобин человека. Хотя кровь таких свиней нельзя было использовать напрямую для переливания людям, гемоглобин можно было очищать и использовать для производства заменителя крови. [13]

Паклитаксел (таксол) [ править ]

Bristol-Myers Squibb производит паклитаксел, используя Penicillium raistrickii и ферментацию растительных клеток (PCF). [ необходима цитата ]

Артемизинин [ править ]

Трансгенные дрожжи используются для производства артемизинина , а также ряда аналогов инсулина . [14]

См. Также [ править ]

  • Молекулярная биотехнология (журнал)
  • Изоляты Bacillus
  • Изоляты грибков
  • Лекарственные формы
  • Губчатые изоляты
  • Изоляты Streptomyces

Ссылки [ править ]

  1. ^ a b c «Человеческий инсулин: захват золотой плазмиды». Новости науки . 114 (12): 195. 1978-09-16. DOI : 10.2307 / 3963132 .
  2. ^ Брар, Дипиндер: «История инсулина» http://www.med.uni-giessen.de/itr/history/inshist.html , по состоянию на 14 июня 2006 г.
  3. ^ "Лаборатория галстука для гормона роста человека". Новости науки . 116 (2): 22. 1979-07-14. DOI : 10.2307 / 3964172 .
  4. ^ Walgate R (март 1981). «Опадание гипофиза» . Природа . 290 (5801): 6–7 nbgcyt5. DOI : 10.1038 / 290006b0 . PMID 7207586 . 
  5. ^ a b c d e Goeddel DV, Heyneker HL, Hozumi T. и др. (Октябрь 1979 г.). «Прямая экспрессия в Escherichia coli последовательности ДНК, кодирующей гормон роста человека». Природа . 281 (5732): 544–8. DOI : 10.1038 / 281544a0 . PMID 386136 . 
  6. ↑ White GC, McMillan CW, Kingdon HS, Shoemaker CB (январь 1989 г.). «Использование рекомбинантного антигемофильного фактора в лечении двух пациентов с классической гемофилией». N. Engl. J. Med . 320 (3): 166–70. DOI : 10.1056 / NEJM198901193200307 . PMID 2492083 . 
  7. ^ a b Кауфман Р.Дж., Уэсли Л.С., Фьюри BC, Фьюри Б., Сапожник CB (июль 1986 г.). «Экспрессия, очистка и характеристика рекомбинантного гамма-карбоксилированного фактора IX, синтезированного в клетках яичников китайского хомячка» . J. Biol. Chem . 261 (21): 9622–8. PMID 3733688 . 
  8. ^ а б Тул Дж. Дж., Кнопф Дж. Л., Возни Дж. М. и др. (1984). «Молекулярное клонирование кДНК, кодирующей антигемофильный фактор человека». Природа . 312 (5992): 342–7. DOI : 10.1038 / 312342a0 . PMID 6438528 . стр. 343 
  9. ^ Кауфман, страницы 9622-3
  10. ^ Кауфман, страница 9623
  11. ^ Кауфман, страница 9626
  12. ^ Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США: «Лицензирование первого фактора свертывания на основе рекомбинантной ДНК», https://www.fda.gov/bbs/topics/NEWS/NEW00312.html , по состоянию на 17 июня 2006 г.
  13. ^ O'Donnell JK, Мартин MJ, Логан JS, Kumar R (1993). «Производство человеческого гемоглобина у трансгенных свиней: подход к кровезаменителю». Обнаружение рака. Пред . 17 (2): 307–12. PMID 8402717 . 
  14. ^ Марк Пеплоу. «Санофи запускает производство лекарств от малярии | Мир химии» . Rsc.org . Проверено 17 декабря 2013 . CS1 maint: обескураженный параметр ( ссылка )