Из Википедии, бесплатной энциклопедии
  (Перенаправлен с синего белого экрана )
Перейти к навигации Перейти к поиску
Чашка с агаром LB показывает результат сине-белого экрана.

Сине-белого экран является скринингом метода , который позволяет для быстрого и удобного обнаружения рекомбинантных бактерий в векторе - молекулярное клонирование экспериментов. Этот метод скрининга обычно выполняется с использованием подходящего бактериального штамма , но также могут использоваться другие организмы, такие как дрожжи. Интересующая ДНК лигируется в вектор . Затем вектор вставляют в компетентную клетку-хозяин, пригодную для трансформации, которую затем выращивают в присутствии X-gal . Клетки, трансформированные векторами, содержащими рекомбинантную ДНКбудут производить белые колонии; клетки, трансформированные нерекомбинантными плазмидами (т.е. только вектором), превращаются в синие колонии.

Фон [ править ]

Молекулярное клонирование - одна из наиболее часто используемых процедур в молекулярной биологии . Представляющий интерес ген может быть вставлен в плазмидный вектор посредством лигирования , а затем плазмида трансформируется в клетки Escherichia coli . Однако не все плазмиды, трансформированные в клетки, могут содержать желаемую генную вставку, и проверка каждой отдельной колонии на наличие вставки занимает много времени. Таким образом, метод обнаружения вставки был бы полезен, чтобы сделать эту процедуру менее трудоемкой и трудоемкой. Одним из первых методов, разработанных для обнаружения вставки, является сине-белый скрининг, который позволяет идентифицировать успешные продукты реакций клонирования по цвету бактерий. колония.

Метод основан на принципе α-комплементации гена β-галактозидазы . Этот феномен α-комплементации был впервые продемонстрирован в работе, выполненной Агнес Ульманн в лаборатории Франсуа Жакоба и Жака Моно , где было показано, что функция неактивной мутантной β-галактозидазы с удаленной последовательностью восстанавливается фрагментом β-галактозидазы. в которой та же самая последовательность, α-донорный пептид, еще не повреждена. [1] Лэнгли и др. показали, что мутантная нефункциональная β-галактозидаза частично лишена своего N-конца с удаленными остатками 11-41, но она может быть дополнена пептидом, образованным из остатков 3-90 β-галактозидазы.[2] Нитчатый фаг M13, содержащий последовательность, кодирующую первые 145 аминокислот, был позже сконструирован Messing et al. и α-комплементация с использованием вектора была продемонстрирована образованием синих бляшек, когда клетки, содержащие неактивный белок, были инфицированы фагом и затем выращены в планшетах, содержащих X-gal. [3]

Серия pUC векторов для клонирования плазмид, разработанная Виейрой и Мессингом, была разработана на основе системы M13 и была первой плазмидой, сконструированной для использования преимуществ этого метода скрининга. [4] В этом методе ДНК, лигированная в плазмиду, разрушает α-пептид и, следовательно, процесс комплементации, и не может образоваться функциональная β-галактозидаза. Таким образом, клетки, трансформированные плазмидой, содержащей вставку, образуют белые колонии, тогда как клетки, трансформированные плазмидой без вставки, образуют синие колонии; Таким образом, результат успешной перевязки можно легко определить по белой окраске клеток, образовавшихся из неудачных синих. [5]

Молекулярный механизм [ править ]

Схематическое изображение сине-белого анализа, используемого для скрининга рекомбинантных векторов

β-галактозидаза представляет собой белка , кодируемых LacZ ген лакового оперона , и он существует в виде гомотетрамер в активном состоянии. Однако мутантная β-галактозидаза, происходящая из штамма M15 E. coli, имеет удаленные N-концевые остатки 11-41, и этот мутант, ω-пептид, не может образовывать тетрамер и неактивен. Однако эта мутантная форма белка может полностью вернуться в свое активное тетрамерное состояние в присутствии N-концевого фрагмента белка, α-пептида. Восстановление функции мутантной β-галактозидазы α-пептидом называется α-комплементацией.

В этом методе скрининга штамм E. coli- хозяина несет мутант с делецией lacZ ( lacZΔM15 ), который содержит ω-пептид, в то время как используемые плазмиды несут последовательность lacZα , которая кодирует первые 59 остатков β-галактозидазы, α-пептида. . Ни один из них не работает сам по себе. Однако, когда два пептида экспрессируются вместе, например, когда плазмида, содержащая последовательность lacZα , трансформируется в клетки lacZΔM15 , они образуют функциональный фермент β-галактозидаза .

Метод сине-белого скрининга работает, нарушая этот процесс α-дополнения. Плазмида несет в последовательности lacZα внутренний сайт множественного клонирования (MCS). Этот MCS в последовательности lacZα может быть разрезан рестрикционными ферментами, так что чужеродная ДНК может быть вставлена ​​в ген lacZα , тем самым разрушая ген, продуцирующий α-пептид. Следовательно, в клетках, содержащих плазмиду со вставкой, не может образовываться функциональная β-галактозидаза .

Присутствие активной β-галактозидазы может быть обнаружено с помощью X-gal , бесцветного аналога лактозы, который может расщепляться β-галактозидазой с образованием 5-бром-4-хлориндоксила, который затем спонтанно димеризуется и окисляется с образованием ярко-синий нерастворимый пигмент 5,5'-дибром-4,4'-дихлор-индиго. Это приводит к характерному синему цвету в клетках, содержащих функциональную β-галактозидазу. Таким образом, синие колонии показывают, что они могут содержать вектор с непрерывным lacZα (следовательно, без вставки), в то время как белые колонии, где X-gal не гидролизуется, указывают на присутствие вставки в lacZα, которая нарушает образование активной β-галактозидазы. .

Рекомбинантные клоны могут быть дополнительно проанализированы путем выделения и очистки небольших количеств плазмидной ДНК из трансформированных колоний, а рестрикционные ферменты можно использовать для разрезания клона и определения того, есть ли в нем интересующий фрагмент. [6] Если ДНК необходимо секвенировать, плазмиды из колоний должны быть выделены на определенном этапе, будь то разрезание с использованием рестрикционных ферментов или выполнение других анализов.

Практические соображения [ править ]

Правильный тип векторных и компетентных клеток - важные соображения при планировании сине-белого экрана. Плазмида должна содержать lacZ α, и примерами таких плазмид являются pUC19 и pBluescript . E.coli , клетка должна содержать мутантный LacZ ген с удаленной последовательности (т.е. lacZΔM15 ), а некоторые из наиболее часто используемых клеток с таким генотипом являются JM109, DH5 & alpha ; и XL1-Blue. Также следует понимать, что на lac-оперон влияет присутствие глюкозы. Белок EIIA Glc, который участвует в импорте глюкозы, отключает пермеазу лактозы, когда глюкоза транспортируется в клетку. Поэтому среда, используемая в чашке с агаром, не должна содержать глюкозу.

X-gal чувствителен к свету, поэтому его раствор и планшеты, содержащие X-gal, следует хранить в темноте. Изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG), который функционирует как индуктор lac- оперона, можно использовать в среде для усиления экспрессии LacZ.

X-gal - дорогой материал, поэтому были разработаны другие методы для скрининга бактерий. GFP был разработан как альтернатива для скрининга бактерий. Эта концепция аналогична α-комплементации, при которой вставка ДНК может нарушить кодирующую последовательность в векторе и, таким образом, нарушить продукцию GFP, что приведет к образованию нефлуоресцирующих бактерий. [7]Бактерии, которые имеют рекомбинантные векторы (вектор + вставка), будут белыми и не будут экспрессировать белок GFP, в то время как нерекомбинантные (вектор) будут флуоресцировать в УФ-свете. GFP в целом использовался в качестве репортерного гена, с помощью которого люди могут окончательно определить, несет ли клон ген, анализируемый исследователями. Иногда среда, в которой растут колонии, может влиять на экран и давать ложноположительные результаты. [8] X-gal в среде может иногда разлагаться с образованием синего цвета или GFP может потерять свою флуоресценцию из-за среды и может повлиять на возможности исследователей определять колонии с желаемым рекомбинантным и те, которые им не обладают. [9]

Недостатки [ править ]

Некоторые белые колонии могут не содержать желаемую рекомбинантную плазмиду по ряду причин. Лигированная ДНК может быть неправильной или неправильно лигирована, и возможно, что некоторый линеаризованный вектор будет трансформирован, его концы «отремонтированы» и лигированы вместе, так что не образуется LacZα и не могут образовываться синие колонии. Мутация также может привести к неэкспрессии α-фрагмента. Колония, вообще не имеющая переносчика, также будет иметь белый цвет и иногда может выглядеть как колония-спутник после приема антибиотика.использованный был истощен. Также возможно, что синие колонии могут содержать вставку. Это происходит, когда вставка находится «в рамке» с геном LacZα и во вставке отсутствует кодон STOP. Это может привести к экспрессии слитого белка, который имеет функциональный LacZα, если его структура не нарушена. Правильная рекомбинантная конструкция может иногда давать более светлые синие колонии, что может затруднить ее идентификацию.

См. Также [ править ]

  • Дополнительный тест
  • pBLU
  • pЗеленый
  • pUC19
  • Рекомбинантная ДНК

Ссылки [ править ]

  1. ^ Ullmann, A .; Джейкоб, Ф .; Моно, Дж. (1967). «Характеристика путем комплементации in vitro пептида, соответствующего проксимальному к оператору сегменту структурного гена бета-галактозидазы Escherichia coli». Журнал молекулярной биологии . 24 (2): 339–343. DOI : 10.1016 / 0022-2836 (67) 90341-5 . PMID  5339877 .
  2. ^ Лэнгли, KE; Вильярехо, MR; Фаулер, А.В.; Zamenhof, PJ; Забин И. (1975). «Молекулярные основы альфа-комплементации бета-галактозидазы» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 72 (4): 1254–1257. DOI : 10.1073 / pnas.72.4.1254 . PMC 432510 . PMID 1093175 .  
  3. ^ Мессинг, Дж .; Gronenborn, B .; Müller-Hill, B .; Ганс Хопшнайдер, П. (1977). «Нитчатый колифаг M13 в качестве носителя для клонирования: вставка фрагмента HindII регуляторной области lac в репликативную форму M13 in vitro» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 74 (9): 3642–3646. Bibcode : 1977PNAS ... 74.3642M . DOI : 10.1073 / pnas.74.9.3642 . PMC 431673 . PMID 333444 .  
  4. ^ Vieira, J .; Мессинг, Дж. (1982). «Плазмиды pUC, производная от M13mp7 система для инсерционного мутагенеза и секвенирования с синтетическими универсальными праймерами». Джин . 19 (3): 259–268. DOI : 10.1016 / 0378-1119 (82) 90015-4 . PMID 6295879 . 
  5. ^ Джозеф Сэмбрук, Дэвид Рассел. "Глава 1". Молекулярное клонирование - лабораторное руководство . 1 (3-е изд.). п. 1.27. ISBN 978-0-87969-577-4.
  6. ^ Дж., Нинфа, Александр (1998). Фундаментальные лабораторные подходы к биохимии и биотехнологии . Баллоу, Дэвид П. Бетесда, Мэриленд: Fitzgerald Science Press. С. 355–356. ISBN 1891786008. OCLC  38325074 .
  7. ^ Speltz, Элизабет Б.; Риган, Линн (июнь 2013 г.). «Белый и зеленый скрининг с круговым клонированием с удлинением полимеразы для простого и надежного клонирования» . Белковая наука . 22 (6): 859–864. DOI : 10.1002 / pro.2268 . PMC 3690724 . PMID 23592493 .  
  8. ^ Банерджи, Сампали; Кумар, Джитендра; Апте-Дешпанде, Анджали; Падманабхан, Шрирам (11 мая 2010 г.). «Новый прокариотический вектор для идентификации и отбора рекомбинантов: прямое использование вектора для исследования экспрессии в E. coli» . Фабрики микробных клеток . 9 : 30. DOI : 10,1186 / 1475-2859-9-30 . ISSN 1475-2859 . PMC 2882348 . PMID 20459760 .   
  9. ^ Банерджи, Сампали; Кумар, Джитендра; Апте-Дешпанде, Анджали; Падманабхан, Шрирам (11 мая 2010 г.). «Новый прокариотический вектор для идентификации и отбора рекомбинантов: прямое использование вектора для исследования экспрессии в E. coli» . Фабрики микробных клеток . 9 : 30. DOI : 10,1186 / 1475-2859-9-30 . ISSN 1475-2859 . PMC 2882348 . PMID 20459760 .