Система бесклеточной является в пробирке инструмент широко используется для изучения биологических реакций , которые происходят в пределах клеток , кроме полной клеточной системы, тем самым уменьшая сложные взаимодействия обычно встречаются при работе в целой клетки. [1] Субклеточные фракции могут быть выделены ультрацентрифугированием, чтобы обеспечить молекулярный механизм, который можно использовать в реакциях в отсутствие многих других клеточных компонентов. [2] Внутреннее устройство эукариотических и прокариотических клеток было использовано для создания этих упрощенных сред. [3] [4] Эти системы позволили использовать сотовую связь.Появится синтетическая биология , обеспечивающая контроль над тем, какая реакция исследуется, а также ее результативность, и уменьшение соображений, которые в противном случае возникают при работе с более чувствительными живыми клетками. [5]
Типы
Бесклеточные системы можно разделить на две основные классификации: на основе клеточного экстракта, которые удаляют компоненты изнутри целой клетки для внешнего использования, и на основе очищенных ферментов, в которых используются очищенные компоненты молекул, которые, как известно, участвуют в данном процессе. . [6] [7] Тип, основанный на клеточном экстракте, подвержен таким проблемам, как быстрое разложение компонентов вне их хозяина, как показано в исследовании Kitaoka et al. где бесклеточная система трансляции на основе Escherichia coli ( E. coli ) типа клеточного экстракта очень быстро разрушала матрицу мРНК и приводила к остановке синтеза белка . [8]
Подготовка
Способы приготовления варьируются в зависимости от ситуации с обоими типами бесклеточных систем.
На основе клеточного экстракта
Нобелевский победитель Бухнер был , возможно , первым представить систему бесклеточной с использованием дрожжей экстрактов, но с тех пор были найдены альтернативные источники. [9] [10] Ретикулоциты E. coli , зародышей пшеницы и кролика оказались полезными для создания бесклеточных систем путем экстракции их внутренних компонентов. [3] [11] Экстракты E. coli 30S были получены, например, путем измельчения бактерий с оксидом алюминия с последующей очисткой. [12] Точно так же зародыши пшеницы измельчали с промытым кислотой песком или порошковым стеклом, чтобы вскрыть клеточные мембраны . [13] [14] Ретикулоциты кроликов были лизированы в растворе MgCl 2, а экстракт отфильтровали от мембран путем центрифугирования. [15]
Очищенный на основе ферментов
Биосистемы биотрансформации бесклеточного пути синтеза могут быть получены путем смешивания ряда очищенных ферментов и коферментов . [3] [16] Например, прочно связанные рибосомы , которые являются компактными и высокоактивными, были извлечены и очищены из E. coli путем центрифугирования в градиенте плотности сахарозы . [17] [7]
Использует
Бесклеточные биосистемы биотрансформации синтетического пути предлагаются в качестве новой недорогой платформы для биопроизводства по сравнению с микробной ферментацией, используемой в течение тысяч лет. [3] [16] Бесклеточные биосистемы имеют несколько преимуществ, подходящих для промышленного применения: [6]
- Очень высокий выход продукта обычно достигается без образования побочных продуктов или синтеза клеточной массы. Например, с синтетическим ферментным путем, из реакции с крахмалом и водой.
- C 6 H 10 O 5 (л) + 7 H 2 O (л) → 12 H 2 (г) + 6 CO 2 (г),
- На одну глюкозную единицу полисахаридов и воды было произведено около 12 H 2 , что в три раза превышает теоретический выход лучших анаэробных продуцирующих водород микроорганизмов . [18]
- Биосистемы in vitro могут осуществлять некоторые биологические реакции, которые раньше не могли реализовать живые микробы или химические катализаторы . Например, целлюлоза, связанная бета-1,4-глюкозидной связью, может быть преобразована в крахмал, связанный альфа-1,4-глюкозидной связью, с помощью смеси внутриклеточных и внеклеточных ферментов в одном реакционном контейнере. [19]
- Ферментативные системы без барьера клеточной мембраны обычно имеют более высокую скорость реакции, чем микробные системы. Например, ферментные топливные элементы обычно имеют гораздо более высокую выходную мощность, чем микробные топливные элементы. [20]
- Ферментные коктейли лучше переносят токсичные соединения, чем микроорганизмы. [21]
- Смеси ферментов обычно работают в широких условиях реакции, таких как высокая температура, низкий pH , присутствие органических растворителей или ионных жидкостей . [16]
Синтез белка
Биосистемами in vitro можно легко управлять, и к ним можно получить доступ без мембран. [16] Примечательно, что в работе, ведущей к Нобелевской премии, в эксперименте Ниренберга и Маттеи использовалась бесклеточная система типа клеточного экстракта для включения выбранных радиоактивно меченных аминокислот в синтезированные белки с 30S, экстрагированными из E. coli . [12] [22] Более поздние исследования, такие как исследование, проведенное Spirin et al. с прокариотической и эукариотической версией их бесклеточной системы трансляции, также синтезировали белки с увеличенным производством, используя такие методы, как непрерывный поток для добавления материалов и удаления продуктов. [23] С такими достижениями в урожайности были расширены приложения для повышения продуктивности, такие как синтез гибридных белков, которые потенциально могут служить вакцинами от B-клеточных лимфом . [24] Кроме того, бесклеточный синтез белка становится новой альтернативой быстрому синтезу белка. [6]
Метаболические манипуляции
Инженерия метаболических процессов была достигнута с помощью бесклеточных систем. [25] [10] [3] Bujara et al. , например, смогли использовать экстракты гликолитической сети, состоящие из ферментов из E. coli, которые продуцируют дигидроксиацетонфосфат , для анализа в реальном времени концентраций метаболитов при изменении уровней ферментов с конечным результатом оптимального производства дигидроксиацетонфосфата . [26] Кроме того, Калхун и Шварц смогли использовать гликолитический промежуточный продукт для подпитки бесклеточной системы, что позволило получить относительно недорогое производство АТФ по сравнению с использованием реагентов в реакциях фосфоенолпирувата . [27]
Включение неприродных аминокислот
Бесклеточные системы также использовались для включения неприродных аминокислот . [27] [28] Shimizu et al. смогли заменить стоп-кодон на смысловой , пропустив фактор высвобождения RF1 , что указывает на способность вставлять желаемые аминокислоты в неестественных ситуациях. Это используется в системах, где работа внутри клетки проблематична, например, процесс метаболизма аминокислот, предотвращающий специфическое мечение аминокислот, которое было бы полезно в многомерной ЯМР-спектроскопии . [29] Кигава и др. смогли успешно пометить аминокислоты в бесклеточной системе, где метаболизм аминокислот больше не присутствовал, что сделало такие системы полезными для исследований ЯМР. [29]
Рекомендации
- ^ Шварц, Джим (2006-07-01). «Разработка бесклеточной биологии для промышленного применения». Журнал промышленной микробиологии и биотехнологии . 33 (7): 476–485. DOI : 10.1007 / s10295-006-0127-у . ISSN 1367-5435 . PMID 16761165 .
- ^ «Браузер MeSH» . meshb.nlm.nih.gov . Проверено 18 октября 2017 .
- ^ а б в г д Грегорио, Николь Э .; Левин, Макс З .; Оза, Джавин П. (2019). «Руководство пользователя по бесклеточному синтезу белка» . Методы и протоколы . 2 (1): 24. DOI : 10,3390 / mps2010024 . PMC 6481089 . PMID 31164605 .
- ^ Земелла, Энн; Торинг, Лена; Хоффмайстер, Кристиан; Кубик, Стефан (01.11.2015). «Бесклеточный синтез белка: плюсы и минусы прокариотических и эукариотических систем» . ChemBioChem . 16 (17): 2420–2431. DOI : 10.1002 / cbic.201500340 . ISSN 1439-7633 . PMC 4676933 . PMID 26478227 .
- ^ Лу, Юань (2017). «Бесклеточная синтетическая биология: инженерия в открытом мире» . Синтетическая и системная биотехнология . 2 (1): 23–27. DOI : 10.1016 / j.synbio.2017.02.003 . PMC 5625795 . PMID 29062958 .
- ^ а б в Роллин, Джозеф А .; Там, Цз Кин; Чжан, Ю.-Х. Персиваль (21.06.2013). «Новая парадигма биотехнологии: бесклеточные биосистемы для биопроизводства». Зеленая химия . 15 (7): 1708 DOI : 10.1039 / c3gc40625c . ISSN 1463-9270 .
- ^ а б Симидзу, Ёсихиро; Иноуэ, Акио; Томари, Юкихидэ; Судзуки, Цутому; Йокогава, Такаши; Нисикава, Кадзуя; Уэда, Такуя (23.05.2001). «Бесклеточный перевод, восстановленный очищенными компонентами». Природа Биотехнологии . 19 (8): 751–755. DOI : 10.1038 / 90802 . PMID 11479568 .
- ^ Китаока, Ёсихиса; Нисимура, Норихиро; Нивано, Мицуру (1996). «Кооперативность стабилизированной мРНК и повышенная активность трансляции в бесклеточной системе». Журнал биотехнологии . 48 (1–2): 1–8. DOI : 10.1016 / 0168-1656 (96) 01389-2 . PMID 8818268 .
- ^ Barnett, James A .; Лихтенталер, Фридер В. (15 марта 2001 г.). «История исследования дрожжей 3: Эмиль Фишер, Эдуард Бухнер и их современники, 1880-1900». Дрожжи . 18 (4): 363–388. DOI : 10.1002 / 1097-0061 (20010315) 18: 4 <363 :: АИД-YEA677> 3.0.CO; 2-R . ISSN 1097-0061 .
- ^ а б Шварц, Джеймс Р. (01.01.2012). «Преобразование биохимической инженерии с бесклеточной биологией». Журнал Айше . 58 (1): 5–13. DOI : 10.1002 / aic.13701 . ISSN 1547-5905 .
- ^ Штиге, Вольфганг; Эрдманн, Фолькер А. (1995). «Возможности системы биосинтеза белков in vitro». Журнал биотехнологии . 41 (2–3): 81–90. DOI : 10.1016 / 0168-1656 (95) 00005-б . PMID 7654353 .
- ^ а б Matthaei H .; Ниренберг (1962). «Характеристики и стабилизация синтеза чувствительных к ДНКазам белков в экстрактах E. coli » . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 47 (10): 1580–1588. Bibcode : 1961PNAS ... 47.1580M . DOI : 10.1073 / pnas.47.10.1580 . PMC 223177 . PMID 14471391 .
- ^ Андерсон, Карл У .; Штраус, Дж. Уильям; Дудок, Бернард С. (1983). «[41] Приготовление бесклеточной белковой синтезирующей системы из зародышей пшеницы». Рекомбинантная ДНК Часть C . Методы в энзимологии. 101 . С. 635–644 . DOI : 10.1016 / 0076-6879 (83) 01044-7 . ISBN 9780121820015. PMID 6888279 .
- ^ Мадин, Кайрат; Савасаки, Тацуя; Огасавара, Томио; Эндо, Яэта (18 января 2000 г.). «Высокоэффективная и надежная система бесклеточного синтеза белка, полученная из зародышей пшеницы: растения, по-видимому, содержат систему самоубийства, направленную на рибосомы» . Труды Национальной академии наук . 97 (2): 559–564. Bibcode : 2000PNAS ... 97..559M . DOI : 10.1073 / pnas.97.2.559 . ISSN 0027-8424 . PMC 15369 . PMID 10639118 .
- ^ Вудворд, Уильям Р .; Айви, Джоэл Л .; Герберт, Эдвард (1974). «[67a] Синтез белка с препаратами кроличьих ретикулоцитов». Нуклеиновые кислоты и синтез белков Часть F . Методы в энзимологии. 30 . С. 724–731 . DOI : 10.1016 / 0076-6879 (74) 30069-9 . ISBN 9780121818937. PMID 4853925 .
- ^ а б в г YH Персиваль Чжан (март 2010 г.). «Производство биоматериалов и биоэлектричества путем биотрансформации бесклеточного синтетического ферментативного пути: проблемы и возможности». Биотехнология и биоинженерия . 105 (4): 663–677. DOI : 10.1002 / bit.22630 . PMID 19998281 .
- ^ Мехта, Прити; Ву, Перри; Венкатараман, Критика; Карзай, А. Вали (2012). Бактериальная регуляторная РНК . Методы молекулярной биологии. 905 . Humana Press, Тотова, Нью-Джерси. С. 273–289. DOI : 10.1007 / 978-1-61779-949-5_18 . ISBN 9781617799488. PMC 4607317 . PMID 22736011 .
- ^ Чжан Ю.Х., Эванс Б.Р., Миленц Дж.Р., Хопкинс Р.С., Адамс М.В. (2007). «Производство водорода с высоким выходом из крахмала и воды синтетическим ферментативным путем» . PLoS ONE . 2 (5): e456. Bibcode : 2007PLoSO ... 2..456Z . DOI : 10.1371 / journal.pone.0000456 . PMC 1866174 . PMID 17520015 .
- ^ Ю Си, Чен Х, Мён С., Сатицуксано Н., Ма Х, Чжан ХЗ, Ли Дж, Чжан ЙХ (2013). «Ферментативное превращение непищевой биомассы в крахмал» . Труды Национальной академии наук . 110 (18): 7182–7187. Bibcode : 2013PNAS..110.7182Y . DOI : 10.1073 / pnas.1302420110 . PMC 3645547 . PMID 23589840 .
- ^ Чжу З., Кин Там Т., Сун Ф, Ю Си, Персиваль Чжан Й. (2014). «Сахарная биобатарея с высокой энергетической плотностью на основе синтетического ферментативного пути» . Nature Communications . 5 : 3026. Bibcode : 2014NatCo ... 5.3026Z . DOI : 10.1038 / ncomms4026 . PMID 24445859 .
- ^ Ван, Йиран; Хуанг, Вэйдун; Сатитсуксано, Ноппадон; Чжу, Чжигуан; Чжан, Ю.-Х. Персиваль (2011). «Биогидрирование из биомассы сахара, опосредованное синтетическими ферментативными путями in vitro» . Химия . 18 (3): 372–380. DOI : 10.1016 / j.chembiol.2010.12.019 . PMID 21439482 .
- ^ Ниренберг, MW и Matthaei, HJ (1961). «Зависимость внеклеточного синтеза белка в E. coli от природных или синтетических полирибонуклеотидов» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 47 (10): 1588–1602. Полномочный код : 1961PNAS ... 47.1588N . DOI : 10.1073 / pnas.47.10.1588 . PMC 223178 . PMID 14479932 .
- ^ Спирин, АС; Баранов В.И.; Рябова, Л.А.; Оводов С.Ю .; Алахов, ЮБ (1988-11-25). «Система непрерывной бесклеточной трансляции, способная производить полипептиды с высоким выходом». Наука . 242 (4882): 1162–1164. Bibcode : 1988Sci ... 242.1162S . DOI : 10.1126 / science.3055301 . ISSN 0036-8075 . PMID 3055301 .
- ^ Ян, Цзюньхао; Кантер, Грегори; Волошин Алексей; Мишель-Рейделле, Натали; Велкин, Хендрик; Леви, Рональд; Шварц, Джеймс Р. (2005-03-05). «Быстрая экспрессия вакцинных белков для В-клеточной лимфомы в бесклеточной системе». Биотехнология и биоинженерия . 89 (5): 503–511. DOI : 10.1002 / bit.20283 . ISSN 1097-0290 . PMID 15669088 .
- ^ Тинафар, Эйдан; Хаэнес, Катарина; Парди, Кейт (8 августа 2019 г.). «Синтетическая биология становится бесклеточной» . BMC Biology . 17 (1). DOI : 10.1186 / s12915-019-0685-х .
- ^ Буджара, Матиас; Шюмперли, Михаэль; Пелло, Рене; Хайнеманн, Матиас ; Панке, Свен (2011). «Оптимизация схемы гликолиза in vitro с помощью метаболического анализа в реальном времени» (PDF) . Природа Химическая биология . 7 (5): 271–277. DOI : 10,1038 / nchembio.541 . PMID 21423171 .
- ^ а б Calhoun, Kara A .; Шварц, Джеймс Р. (2005-06-05). «Активизация внеклеточного синтеза белка с метаболизмом глюкозы» . Биотехнология и биоинженерия . 90 (5): 606–613. DOI : 10.1002 / bit.20449 . ISSN 1097-0290 . PMID 15830344 .
- ^ Норен, CJ; Энтони-Кэхилл, SJ; Гриффит, MC; Шульц, П.Г. (14 апреля 1989 г.). «Общий метод сайт-специфического включения неприродных аминокислот в белки». Наука . 244 (4901): 182–188. Bibcode : 1989Sci ... 244..182N . DOI : 10.1126 / science.2649980 . ISSN 0036-8075 . PMID 2649980 .
- ^ а б Кигава, Таканори; Муто, Ютака; Ёкояма, Шигеюки (01.09.1995). «Бесклеточный синтез и аминокислотно-селективное мечение стабильных изотопов белков для анализа ЯМР». Журнал биомолекулярного ЯМР . 6 (2): 129–134. DOI : 10.1007 / bf00211776 . ISSN 0925-2738 .