Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

Анализ клеточного цикла путем измерения содержания ДНК - это метод, который наиболее часто использует проточную цитометрию для различения клеток в разных фазах клеточного цикла . Перед анализом клетки обычно пермеабилизируют и обрабатывают флуоресцентным красителем , количественно окрашивающим ДНК , таким как йодид пропидия (PI) или 4,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI). Интенсивность флуоресценции окрашенных клеток коррелирует с количеством содержащейся в них ДНК. Поскольку содержание ДНК удваивается во время фазы S , содержание ДНК (и, следовательно, интенсивность флуоресценции) клеток в фазе G 0 и G1 фаза (до S), в фазе S, и в G 2 фазы и M фазы (после S) идентифицирует положение фазы клеточного цикла в основных фазах (G 0 / G 1 по сравнениюSсравнениюG 2 / Мфаза) клеточного цикла. Содержание клеточной ДНК в отдельных клетках часто отображается в виде гистограммы их частот, чтобы предоставить информацию об относительной частоте (процентном соотношении) клеток в основных фазах клеточного цикла.

Аномалии клеточного цикла, обнаруженные на гистограмме частотного содержания ДНК, часто наблюдаются после различных типов повреждения клеток, например такого повреждения ДНК, которое прерывает развитие клеточного цикла в определенных контрольных точках . Такая остановка развития клеточного цикла может привести либо к эффективной репарации ДНК, которая может предотвратить превращение нормальных клеток в раковые ( канцерогенез ), либо к гибели клеток, часто в результате апоптоза . Остановка клеток в G 0 или G 1 часто наблюдается в результате недостатка питательных веществ (факторов роста), например, после лишения сыворотки . Анализ клеточного цикла был впервые описан в 1969 г.Научная лаборатория Лос-Аламоса, созданная группой из Калифорнийского университета с использованием техники окрашивания по Фельгену . [1] Первый протокол анализа клеточного цикла с использованием окрашивания йодидом пропидия был представлен в 1975 году Аутаром Кришаном из Гарвардской медицинской школы и до сих пор широко цитируется. [2]

Многопараметрический анализ клеточного цикла включает в себя, помимо измерения содержания клеточной ДНК, другие составляющие / характеристики, связанные с клеточным циклом. Одновременное измерение клеточной ДНК и содержания РНК или восприимчивости ДНК к денатурации при низком pH с использованием метахроматического красителя акридинового оранжевого , выявляет компартменты клеточного цикла G 1Q , G 1A и G 1B, а также позволяет различать S, G 2 и митотические клетки. [3] Клетки в G 1Q находятся в состоянии покоя, временно выведены из клеточного цикла (также обозначаются как G 0 ), G 1A находятся в фазе роста, в то время как G 1Bпредставляют собой клетки непосредственно перед входом в S, их рост (содержание РНК и белка, размер) подобен росту клеток, инициирующих репликацию ДНК. Подобные компартменты клеточного цикла также распознаются с помощью многопараметрического анализа, который включает измерение экспрессии циклина D1 , циклина E , циклина A и циклина B1 , каждый в зависимости от содержания ДНК [4] Одновременное измерение содержания ДНК и включения предшественника ДНК 5- Бром-2'-дезоксиуридин (BrdU) методом проточной цитометрии представляет собой особенно полезный анализ, который широко используется при анализе клеточного цикла in vitro и in vivo. [5] Однако включение 5-этинил-2'-дезоксиуридина(EdU), предшественник, обнаружение которого дает определенные преимущества по сравнению с BrdU, теперь стал предпочтительной методологией обнаружения реплицирующих ДНК (S-фаза) клеток. [6]

Методика эксперимента [ править ]

DAPI (пурпурный) связан с малой бороздкой ДНК (зеленый и синий). Из PDB : 1D30 .

Если окрашивание не проводится с использованием Hoechst 33342 , первым шагом в подготовке клеток для анализа клеточного цикла является пермеабилизация плазматических мембран клеток . Обычно это делается путем их инкубации в буферном растворе, содержащем мягкий детергент [7], например Triton X-100 или NP-40 , или путем фиксации в этаноле . Большинство флуоресцентных красителей ДНК (одно из исключений - Hoechst 33342 ) не проникают через плазматическую мембрану, то есть не могут проходить через неповрежденную клеточную мембрану. Следовательно, проницаемость имеет решающее значение для успеха следующего шага - окрашивания клеток.

Перед (или во время стадии окрашивания) клетки часто обрабатывают РНКазой А для удаления РНК . Это важно, потому что некоторые красители, окрашивающие ДНК, также окрашивают РНК, создавая артефакты , искажающие результаты. Исключением является метахроматический флуорохром акридиновый оранжевый , который в соответствии с конкретным протоколом окрашивания может дифференцированно окрашивать как РНК (генерируя красную люминесценцию), так и ДНК (зеленую флуоресценцию), или в другом протоколе после удаления РНК и частичной денатурации ДНК для дифференциального окрашивания. двухцепочечная ДНК (зеленая флуоресценция) по сравнению с одноцепочечной ДНК (красная люминесценция) [3]. Помимо йодида пропидия и акридинового оранжевого, количественно используемые красители включают (но не ограничиваются ими) DRAQ5, 7-аминоактиномицин D , DAPI и Hoechst 33342 .

Двойная дискриминация [ править ]

Поскольку клетки и особенно фиксированные клетки имеют тенденцию слипаться, агрегаты клеток должны быть исключены из анализа с помощью процесса, называемого дискриминацией дублетов . Это важно, потому что дублет двух клеток G 0 / G 1 имеет такое же общее содержание ДНК и, следовательно, такую ​​же интенсивность флуоресценции, как и одиночная клетка G 2 / M. [8] [9] Если дублеты G 0 / G 1 не распознаются как таковые, они будут способствовать ложноположительной идентификации и подсчету клеток G 2 / M.

Связанные методы [ править ]

Тест Николетти [ править ]

Анализ Николетти , названный в честь его изобретателя, итальянского врача Ильдо Николетти , представляет собой модифицированную форму анализа клеточного цикла. Он используется для обнаружения и количественной оценки апоптоза , формы запрограммированной гибели клеток , путем анализа клеток с содержанием ДНК менее 2n (« клетки sub-G 0 / G 1 »). Такие клетки обычно являются результатом апоптотической фрагментации ДНК : во время апоптоза ДНК разрушается клеточными эндонуклеазами . Следовательно, ядра апоптотических клеток содержат меньше ДНК, чем ядра здоровых клеток G 0 / G 1 , что приводит к суб-G 0 / G1 пик на гистограмме флуоресценции, который можно использовать для определения относительного количества апоптотических клеток в образце. Этот метод был разработан и впервые описан в 1991 году Николетти и его коллегами из Медицинской школы Университета Перуджи . [10] Оптимизированный протокол, разработанный двумя авторами оригинальной публикации, был опубликован в 2006 году. [11] Объекты, измеренные в пределах пика суб-G 0 / G 1 , с содержанием ДНК менее 5% от пика G 0 G 1 пик, по всей вероятности, являются апоптотическими тельцами и, следовательно, не представляют собой отдельные апоптотические клетки [12]

Анализ Николетти со здоровыми (слева) и апоптотическими (в центре и справа) клетками

  • Здоровые клетки. Обратите внимание на отсутствие пика суб-G 0 / G 1 .

  • Апоптотические клетки через сутки после индукции апоптоза. Обратите внимание на наличие пика суб-G 0 / G 1 .

  • Апоптотические клетки через несколько дней после индукции апоптоза. Обратите внимание на относительное увеличение пика суб-G 0 / G 1 .

Ссылки [ править ]

  1. Перейти ↑ Van Dilla MA, Trujillo TT, Mullaney PF, Coulter JR (14 марта 1969). «Микрофлуориметрия клеток: метод быстрого измерения флуоресценции». Наука . 163 (3872): 1213–1214. Bibcode : 1969Sci ... 163.1213V . DOI : 10.1126 / science.163.3872.1213 . PMID  5812751 .
  2. ↑ Кришан А. (июль 1975 г.). «Быстрый цитофлуориметрический анализ клеточного цикла млекопитающих путем окрашивания йодидом пропидия» . Журнал клеточной биологии . 66 (1): 188–193. DOI : 10,1083 / jcb.66.1.188 . PMC 2109516 . PMID 49354 .  
  3. ^ Darzynkiewicz Z, Traganos F, Меламед MR (1980). «Новые компартменты клеточного цикла, идентифицированные многопараметрической проточной цитометрией». Цитометрия . 1 (2): 98–108. DOI : 10.1002 / cyto.990010203 . PMID 6170495 . 
  4. ^ Darzynkiewicz Z, Гонг ДП, Хуан G, Ardelt В, Traganos F (1996). «Цитометрия циклиновых белков» . Цитометрия . 25 (1): 1–13. DOI : 10.1002 / (SICI) 1097-0320 (19960901) 25: 1 <1 :: AID-CYTO1> 3.0.CO; 2-N . PMID 8875049 . 
  5. ^ Серый JW, Dolbeare F, Pallavicini MG, Beisker W, Вальдман F (1986). «Анализ клеточного цикла с использованием проточной цитометрии». Int J Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med . 49 (2): 237–55. DOI : 10.1080 / 09553008514552531 . PMID 3510993 . 
  6. ^ Бак С.Б., Брэдфорд Дж, Джи К.Р., Агнью Б.Дж., Кларк С.Т., Салик А (2008). «Обнаружение прогрессирования S-фазы клеточного цикла с использованием включения 5-этинил-2'-дезоксиуридина с помощью щелочной химии, альтернативы использованию антител к 5-бром-2'-дезоксиуридину» . Биотехнологии . 44 (7): 927–9. DOI : 10.2144 / 000112812 . PMID 18533904 . 
  7. ^ Винделов LL, Christensen IJ, Ниссен Н.И. (март 1983). «Детергентно-трипсиновый метод подготовки ядер для проточного цитометрического анализа ДНК». Цитометрия . 3 (5): 323–327. DOI : 10.1002 / cyto.990030503 . PMID 6188586 . 
  8. ^ Шарплесс Т, Р Traganos, Darzynkiewicz Z, Меламед MR (1975). «Проточная цитофлуориметрия: различение отдельных клеток и клеточных агрегатов путем прямого измерения размера». Acta Cytol . 19 (6): 577–81. PMID 1108568 . 
  9. ^ Wersto Р.П., Хрестос FJ, Лири И. Ф., Моррис С, Stetler-Stevenson М.А., Габрильсон Е (15 октября 2001 года). «Двойная дискриминация в анализе клеточного цикла ДНК» . Цитометрия . 46 (5): 296–306. DOI : 10.1002 / cyto.1171 . PMID 11746105 . 
  10. ^ Nicoletti I, Migliorati G, Паяцы MC, Grignani F, Риккарди C (3 июня 1991). «Быстрый и простой метод измерения апоптоза тимоцитов с помощью окрашивания йодидом пропидия и проточной цитометрии». Журнал иммунологических методов . 139 (2): 271–279. DOI : 10.1016 / 0022-1759 (91) 90198-O . PMID 1710634 . 
  11. Перейти ↑ Riccardi C, Nicoletti I (9 ноября 2006 г.). «Анализ апоптоза окрашиванием пропидиум йодидом и проточной цитометрией». Протоколы природы . 1 (3): 1458–1461. DOI : 10.1038 / nprot.2006.238 . PMID 17406435 . 
  12. ^ Darzynkiewicz Z, Bedner Е, Traganos F (2001). «Трудности и подводные камни в анализе апоптоза». Методы Cell Biol . 63 : 527–559. DOI : 10.1016 / s0091-679x (01) 63028-0 . PMID 11060857 . 

Дальнейшее чтение [ править ]

  • «Основы клеточного цикла» (PDF) . Университетский колледж Лондона. Архивировано из оригинала (PDF, 0,1 МБ) 06.06.2011 . Проверено 20 мая 2010 .
  • Рабинович, Петр. «Введение в анализ клеточного цикла» (PDF, 0,5 МБ) . Phoenix Flow Systems, Inc . Проверено 20 мая 2010 .