Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Кремнезем в спин-колонке с водой и с образцом ДНК в хаотропном буфере

Очистка нуклеиновых кислот на спин-колонке - это метод твердофазной экстракции для быстрой очистки нуклеиновых кислот . Этот метод основан на том факте, что нуклеиновая кислота будет связываться с твердой фазой кремнезема при определенных условиях.

Процедура [ править ]

Стадиями метода являются лизирование, связывание, отмывка и элюирование. [1] [2] Более конкретно, это влечет за собой лизис клеток - мишеней , чтобы освободить нуклеиновых кислот , избирательное связывание нуклеиновой кислоты с диоксидом кремния мембраны, смывает частицы и ингибиторы, которые не связаны с мембраной с диоксидом кремния, и элюирование нуклеиновых кислота, с конечным результатом - очищенная нуклеиновая кислота в водном растворе.

Для лизиса клетки (кровь, ткань и т. Д.) Образца должны пройти обработку, чтобы разрушить клеточную мембрану и освободить нуклеиновую кислоту. В зависимости от целевого материала это может включать использование детергента или других буферов, протеиназ или других ферментов, нагревание до различного времени / температуры или механическое нарушение, такое как разрезание ножом или гомогенизатором , с использованием ступки и пестика или бусинок. избиение бисерной мельницей.

Затем для связывания к лизированному образцу добавляют буферный раствор вместе с этанолом или изопропанолом . Затем образец в связывающем растворе переносят в спин-колонку , и колонку помещают в центрифугу или подсоединяют к вакууму. Центрифуга / вакуум проталкивает раствор через мембрану из диоксида кремния, которая находится внутри спин-колонки, где при правильных ионных условиях нуклеиновые кислоты будут связываться с мембраной из диоксида кремния по мере прохождения остальной части раствора. Когда целевой материал связан, сквозной поток может быть удален.

Для промывания в колонку добавляют новый буфер, затем центрифугируют / вакуумируют через мембрану. Этот буфер предназначен для поддержания условий связывания при удалении связывающих солей и других оставшихся загрязнителей. Обычно требуется несколько промывок, часто с увеличением процентного содержания этанола / изопропанола, пока нуклеиновая кислота на мембране из диоксида кремния не очистится от загрязнений. Последняя «промывка» часто представляет собой этап сушки, позволяющий спирту испариться, оставляя только очищенные нуклеиновые кислоты связанными с колонкой.

Наконец, элюция - это процесс добавления водного раствора в колонку, позволяющий гидрофильной нуклеиновой кислоте покинуть колонку и вернуться в раствор. Этот этап можно улучшить с помощью соли, pH, времени или тепла. Наконец, для улавливания элюата / элюента колонку переносят в чистую микропробирку перед последним этапом центрифугирования.

Связанные методы [ править ]

Еще до используемых сегодня методов нуклеиновых кислот было известно, что в присутствии хаотропных агентов , таких как йодид натрия или перхлорат натрия , ДНК связывается с кремнеземом, частицами стекла или одноклеточными водорослями, называемыми диатомовыми водорослями, которые защищают свои клеточные стенки кремнеземом . Это свойство использовали для очистки нуклеиновой кислоты с использованием стеклянного порошка или гранул диоксида кремния в щелочных условиях. [3] Позже это было улучшено с использованием тиоцианата гуанидиния или гидрохлорида гуанидиния в качестве хаотропного агента. [4] Для простоты использования стеклянные шарики позже были заменены на кремнеземные колонки. А чтобы использовать инструменты для автоматизированной экстракции, были разработаны парамагнитные шарики с кремнеземным покрытием , которые чаще называют экстракцией «магнитных шариков».

См. Также [ править ]

Ссылки [ править ]

  1. ^ Матсон, Роберт С. (2008). Методы и протоколы микрочипов . Бока-Ратон, Флорида: CRC. С. 27–29. ISBN 978-1420046656.
  2. Перейти ↑ Kumar, Anil (2006). Генная инженерия . Нью-Йорк: Издательство Nova Science. С. 101–102. ISBN 159454753X.
  3. ^ Марко М.А., Чипперфилд Р., Бирнбойм ХК. Процедура крупномасштабного выделения высокоочищенной плазмидной ДНК с использованием щелочной экстракции и связывания со стеклянным порошком. Анальная биохимия. 1982 Апрель; 121 (2): 382-7. PMID 6179438 
  4. ^ Boom R, Sol CJ, Salimans MM, Jansen CL, Wertheim-van Dillen PM, van der Noordaa J. Быстрый и простой метод очистки нуклеиновых кислот. J Clin Microbiol. 1990 Март; 28 (3): 495-503. PMID 1691208