Просвечивающая электронная криомикроскопия

Трансмиссионная электронная криомикроскопия ( CryoTEM ), широко известная как крио-ЭМ , представляет собой форму криогенной электронной микроскопии , а точнее вид просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), при которой образец исследуется при криогенных температурах (обычно температурах жидкого азота ). [1] Крио-ЭМ набирает популярность в структурной биологии . [2]

CryoTEM-изображение GroEL, взвешенного в аморфном льду на 50 000 × увеличение
"> Файл: Structure-of-Alcohol-Oxidase-from-Pichia-pastoris-by-Cryo-Electron-Microscopy-pone. 0159476.s006.ogvВоспроизвести медиа
Структура алкогольоксидазы из Pichia pastoris по CryoTEM

Полезность просвечивающей электронной криомикроскопии проистекает из того факта, что она позволяет наблюдать образцы, которые не были окрашены или закреплены каким-либо образом, показывая их в естественной среде. Это контрастирует с рентгеновской кристаллографией , которая требует кристаллизации образца, что может быть затруднено, и помещения его в нефизиологическую среду, что иногда может приводить к функционально несущественным конформационным изменениям.

Достижения в технологии электронных детекторов , особенно DDE (прямые электронные детекторы), а также более мощные программные алгоритмы визуализации позволили определять макромолекулярные структуры с разрешением, близким к атомному. [3] Изображенные макромолекулы включают вирусы , рибосомы , митохондрии , ионные каналы и ферментные комплексы. Начиная с 2018 года крио-ЭМ может применяться к структурам размером с гемоглобин (64 кДа ) [4] и с разрешением до 1,8 Å . [5] В 2019 году, крио-EM структуры представлены 2,5% структур , депонированных в Protein банка данных , [6] , и это число продолжает расти. [7] Применение крио-ЭМ - криоэлектронная томография (крио-ЭТ), где 3D-реконструкция образца создается из наклонных 2D-изображений.

Первоначальное обоснование CryoTEM было как средство борьбы с радиационным повреждением биологических образцов. Количество излучения, необходимое для получения изображения образца в электронном микроскопе, достаточно велико, чтобы быть потенциальным источником повреждения образца для хрупких структур. Кроме того, высокий вакуум, необходимый для колонки электронного микроскопа, делает среду для образца довольно суровой.

Проблема вакуума была частично решена введением отрицательных пятен, но даже при отрицательных пятнах биологические образцы склонны к разрушению структуры при обезвоживании образца. Возможность погружения образцов во лед при температуре ниже температуры сублимации предполагалась на раннем этапе, но вода имеет тенденцию образовывать кристаллическую решетку более низкой плотности при замерзании, и это может разрушить структуру всего, что в ней заключено.

В начале 1980-х годов несколько групп, изучающих физику твердого тела, пытались получить стекловидный лед различными способами, такими как замораживание под высоким давлением или мгновенное замораживание. В основополагающей статье 1984 года группа под руководством Жака Дюбоше из Европейской лаборатории молекулярной биологии показала изображения аденовируса, заключенного в застеклованный слой воды. [8] Считается, что этот документ указывает на происхождение крио-ЭМ, и этот метод был разработан до такой степени, что стал обычным явлением во многих лабораториях по всему миру.

Энергия электронов, используемых для визуализации (80–300 кВ), достаточно высока для разрыва ковалентных связей . Когда образцы для визуализации уязвимы для радиационного повреждения, необходимо ограничить электронное облучение, используемое для получения изображения. Эти низкие экспозиции требуют, чтобы изображения тысяч или даже миллионов идентичных замороженных молекул были отобраны, выровнены и усреднены для получения карт высокого разрешения с использованием специализированного программного обеспечения. Значительное улучшение структурных характеристик было достигнуто в 2012 году за счет внедрения прямых электронных детекторов и улучшенных вычислительных алгоритмов. [1] [2]

В 2015 году Бриджит Каррагер и ее коллеги из Национального ресурса автоматизированной молекулярной микроскопии Скриппса использовали разработанные ею и Клинтом Поттером методы для определения первой крио-ЭМ-структуры с разрешением менее 3 Å, тем самым подняв CryoTEM как инструмент, сравнимый и потенциально превосходящий традиционным методам рентгеновской кристаллографии. [9] [10] С тех пор было достигнуто более высокое разрешение, включая структуру бактериального фермента β-галактозидазы 2,2 Å в 2015 году [11] и структуру глутаматдегидрогеназы 1,8 Å в 2016 году. [12] Cryo-EM также имеет был использован для определения структуры различных вирусов, включая вирус Зика , [13] и был применен к большим комплексам, таким как сплайсосома . [14] В 2017 году Нобелевская премия по химии была присуждена совместно Жаку Дюбоше , Иоахиму Франку и Ричарду Хендерсону «за разработку криоэлектронной микроскопии для определения структуры биомолекул в растворе с высоким разрешением». [15]

Тонкая пленка

Биологический материал распределяется на сетке электронной микроскопии и сохраняется в замороженном-гидратированном состоянии путем быстрого замораживания, обычно в жидком этане при температуре около жидкого азота . Поддерживая образцы при температуре жидкого азота или более низкой температуре, они могут быть введены в высокотемпературной вакуумной части электронного микроскопа колонки. Большинство биологических образцов чрезвычайно радиочувствительны , поэтому для их визуализации необходимо использовать методы с низкой дозой (полезно, низкая температура просвечивающей электронной криомикроскопии обеспечивает дополнительный фактор защиты от радиационного повреждения).

Следовательно, изображения получаются очень зашумленными . Для некоторых биологических систем возможно усреднение изображений для увеличения отношения сигнал / шум и получения информации с высоким разрешением об образце с использованием метода, известного как анализ отдельных частиц . Этот подход в целом требует, чтобы усредняемые объекты были идентичными, хотя теперь можно изучить некоторую ограниченную конформационную гетерогенность (например, рибосомы ). Трехмерные реконструкции из изображений белковых комплексов и вирусов с помощью CryoTEM были решены с субнанометровым или почти атомным разрешением, что позволило по-новому взглянуть на структуру и биологию этих больших сборок.

Анализ упорядоченных массивов белка, такие как 2-D кристаллы из трансмембранных белков или спиральных массивов белков, а также позволяет своего рода усреднение , который может обеспечить высокое разрешение информации о образце. Этот метод называется электронной кристаллографией .

Стекловидные секции

Метод тонких пленок ограничен тонкими образцами (обычно <500 нм), потому что электроны не могут пересекать более толстые образцы без многократного рассеяния. Более толстые образцы могут быть остеклованы путем погружной заморозки ( криофиксации ) в этане (толщиной до десятков мкм) или, чаще, замораживанием под высоким давлением (до сотен мкм). Затем их можно разрезать на тонкие срезы (толщиной от 40 до 200 нм) алмазным ножом в криоультрамикротоме при температурах ниже -135 ° C (температура расстекловывания). Срезы собираются на сетке электронного микроскопа и отображаются таким же образом, как и образец, остеклованный в тонкой пленке. Этот метод называется просвечивающей электронной криомикроскопией стекловидных срезов (CEMOVIS) или просвечивающей электронной криомикроскопией замороженных гидратированных срезов.

Помимо возможности визуализации застеклованных биологических образцов, CryoTEM также может использоваться для визуализации образцов материалов, которые слишком летучие в вакууме для получения изображений с помощью стандартной электронной микроскопии при комнатной температуре. Например, застеклованные участки границы раздела жидкость-твердое тело могут быть извлечены для анализа с помощью CryoTEM [16], а сера, которая склонна к сублимации в вакууме электронных микроскопов, может быть стабилизирована и отображена в CryoTEM. [17]

В CryoTEM можно использовать различные методы. [18] Популярные техники включают:

  1. Электронная кристаллография
    1. Анализ двумерных кристаллов
    2. Анализ спиральных нитей или трубок
    3. Дифракция электронов на микрокристаллах (MicroED) [19] [20] [21] [22]
  2. Анализ отдельных частиц (SPA)
    1. CryoTEM с временным разрешением [23] [24] [25]
  3. Электронная криотомография (криоЭТ)

  • Криогенная сканирующая электронная микроскопия
  • Банк данных EM
  • Разрешение (электронная плотность)
  • Анализ отдельных частиц

  1. ^ a b Kühlbrandt W (август 2014 г.). «Крио-ЭМ вступает в новую эру» . eLife . 3 : e03678. DOI : 10.7554 / elife.03678 . PMC  4131193 . PMID  25122623 .
  2. ^ а б Callaway E (сентябрь 2015 г.). «Революция не будет кристаллизоваться: новый метод пронизывает структурную биологию» . Природа . 525 (7568): 172–4. Bibcode : 2015Natur.525..172C . DOI : 10.1038 / 525172a . PMID  26354465 .
  3. ^ Мурата К., Вольф М. (февраль 2018 г.). «Криоэлектронная микроскопия для структурного анализа динамических биологических макромолекул» . Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Общие предметы . 1862 (2): 324–334. DOI : 10.1016 / j.bbagen.2017.07.020 . PMID  28756276 .
  4. ^ Хошоуей М., Раджайня М., Баумейстер В., Данев Р. (июнь 2017 г.). «Крио-ЭМ структура гемоглобина при 3,2 Å, определенная с помощью фазовой пластины Вольта» . Nature Communications . 8 : 16099. Bibcode : 2017NatCo ... 816099K . DOI : 10.1038 / ncomms16099 . PMC  5497076 . PMID  28665412 .
  5. ^ Мерк А., Бартесаги А., Банерджи С., Фальконьери В., Рао П., Дэвис М. И., Прагани Р., Боксер МБ, Эрл Л. А., Милн Д. Л., Субраманиам С. (июнь 2016 г.). «Преодоление барьеров разрешения крио-ЭМ для облегчения открытия лекарств» . Cell . 165 (7): 1698–1707. DOI : 10.1016 / j.cell.2016.05.040 . PMC  4931924 . PMID  27238019 .
  6. ^ «Распределение данных PDB экспериментальным методом и молекулярным типом» . www.rcsb.org . Проверено 3 декабря 2019 .
  7. ^ «Статистика PDB: рост структур из экспериментов 3DEM, выпущенных за год» . www.rcsb.org . Проверено 22 декабря 2018 .
  8. ^ Адриан М, Дюбоше Дж, Лепо Дж, МакДауэлл AW (1984). «Криоэлектронная микроскопия вирусов» . Природа . 308 (5954): 32–6. Bibcode : 1984Natur.308 ... 32A . DOI : 10.1038 / 308032a0 . PMID  6322001 . S2CID  4319199 .
  9. ^ Деллисанти, Косма (2015). «Резолюция, разрушающая барьеры». Структурная и молекулярная биология природы . 22 (5): 361. DOI : 10.1038 / nsmb.3025 . S2CID  12198387 .
  10. ^ Кэмпбелл М.Г., Вислер Д., Ченг А., Поттер С.С., Каррагер Б. (март 2015 г.). «Реконструкция с разрешением 2,8 Å протеасомы Thermoplasma acidophilum 20S с использованием криоэлектронной микроскопии» . eLife . 4 . DOI : 10.7554 / eLife.06380 . PMC  4391500 . PMID  25760083 .
  11. ^ Бартесаги А., Мерк А., Банерджи С., Мэттис Д., Ву Х, Милн Дж. Л., Субраманиам С. (июнь 2015 г.). «Крио-ЭМ структура с разрешением 2,2 Å β-галактозидазы в комплексе с ингибитором проницаемости клеток» . Наука . 348 (6239): 1147–51. Bibcode : 2015Sci ... 348.1147B . DOI : 10.1126 / science.aab1576 . PMC  6512338 . PMID  25953817 .
  12. ^ Вонк Дж., Миллс ди-джей (октябрь 2017 г.). «Достижения в крио-ЭМ высокого разрешения олигомерных ферментов» . Текущее мнение в структурной биологии . 46 : 48–54. DOI : 10.1016 / j.sbi.2017.05.016 . PMID  28624735 .
  13. ^ Сирохи Д., Чен З., Сан Л., Клозе Т., Пирсон Т.С., Россманн М.Г., Кун Р.Дж. (апрель 2016 г.). «Крио-ЭМ структура с разрешением 3,8 Å вируса Зика» . Наука . 352 (6284): 467–70. Bibcode : 2016Sci ... 352..467S . DOI : 10.1126 / science.aaf5316 . PMC  4845755 . PMID  27033547 .
  14. ^ Cheng Y (август 2018). «Одночастичная крио-ЭМ-как она попала сюда и куда пойдет» . Наука . 361 (6405): 876–880. Bibcode : 2018Sci ... 361..876C . DOI : 10.1126 / science.aat4346 . PMC  6460916 . PMID  30166484 .
  15. ^ «Нобелевская премия по химии 2017 года - пресс-релиз» . www.nobelprize.org . 4 октября 2017 . Проверено 4 октября 2017 года .
  16. ^ Захман MJ, Asenath-Smith E, Estroff LA, Kourkoutis LF (декабрь 2016 г.). «Специальная подготовка неповрежденных границ раздела твердое тело-жидкость с помощью локализации на месте без этикеток и криофокусированного вывода ионного пучка» . Микроскопия и микроанализ . 22 (6): 1338–1349. Bibcode : 2016MiMic..22.1338Z . DOI : 10.1017 / S1431927616011892 . PMID  27869059 .
  17. ^ Левин Б.Д., Захман М.Дж., Вернер Дж. Г., Сахор Р., Нгуен К. Х., Хан И, Се Б., Ма Л., Арчер Л. А., Джаннелис Е. П., Виснер Ю., Куркутис Л. Ф., Мюллер Д. А. (февраль 2017 г.). "Определение характеристик серных и наноструктурированных серных аккумуляторных катодов в электронной микроскопии без артефактов сублимации" . Микроскопия и микроанализ . 23 (1): 155–162. Bibcode : 2017MiMic..23..155L . DOI : 10.1017 / S1431927617000058 . PMID  28228169 .
  18. ^ Презентация по криоэлектронной микроскопии | PharmaXChange.info
  19. ^ Ши Д., Нанненга Б.Л., Иаданза М.Г., Гонен Т. (ноябрь 2013 г.). «Трехмерная электронная кристаллография микрокристаллов белков» . eLife . 2 : e01345. DOI : 10.7554 / eLife.01345 . PMC  3831942 . PMID  24252878 .
  20. ^ Нанненга Б.Л., Ши Д., Лесли А.Г., Гонен Т. (сентябрь 2014 г.). «Определение структуры с высоким разрешением путем сбора данных непрерывного вращения в MicroED» . Методы природы . 11 (9): 927–930. DOI : 10,1038 / Nmeth.3043 . PMC  4149488 . PMID  25086503 .
  21. ^ Ши Д., Нанненга Б.Л., де ла Крус М.Дж., Лю Дж., Савтель С., Калеро Дж., Рейес Ф. Э., Хаттне Дж., Гонен Т. (май 2016 г.). «Сборник данных MicroED для кристаллографии макромолекул» . Протоколы природы . 11 (5): 895–904. DOI : 10.1038 / nprot.2016.046 . PMC  5357465 . PMID  27077331 .
  22. ^ de la Cruz MJ, Hattne J, Shi D, Seidler P, Rodriguez J, Reyes FE, Sawaya MR, Cascio D, Weiss SC, Kim SK, Hinck CS, Hinck AP, Calero G, Eisenberg D, Gonen T. (февраль 2017 г.) . «Структуры с атомным разрешением из фрагментированных кристаллов белка с помощью метода криоЭМ MicroED» . Методы природы . 14 (4): 399–402. DOI : 10.1038 / nmeth.4178 . PMC  5376236 . PMID  28192420 .
  23. ^ Фу З., Каледхонкар С., Борг А., Сун М., Чен Б., Грассуччи Р.А., Эренберг М., Франк Дж. (Декабрь 2016 г.). «Ключевые промежуточные продукты в рециклинге рибосом, визуализированные с помощью криоэлектронной микроскопии с временным разрешением» . Структура . 24 (12): 2092–2101. DOI : 10.1016 / j.str.2016.09.014 . PMC  5143168 . PMID  27818103 .
  24. ^ Фэн Х, Фу З, Каледхонкар С., Цзя Й, Шах Б., Джин А., Лю З., Сун М., Чен Б., Грассуччи Р. А., Рен И., Цзян Х., Франк Дж., Линь Q (апрель 2017 г.) «Быстрый и эффективный метод микрожидкостного распыления-погружения для крио-ЭМ одиночных частиц с высоким разрешением» . Структура . 25 (4): 663–670.e3. DOI : 10.1016 / j.str.2017.02.005 . PMC  5382802 . PMID  28286002 .
  25. ^ Чен Б., Каледхонкар С., Сун М., Шен Б., Лу З., Барнард Д., Лу Т.М., Гонсалес Р.Л., Фрэнк Дж. (Июнь 2015 г.). «Структурная динамика ассоциации субъединиц рибосомы изучена с помощью криогенной электронной микроскопии с временным разрешением смешивания-распыления» . Структура . 23 (6): 1097–105. DOI : 10.1016 / j.str.2015.04.007 . PMC  4456197 . PMID  26004440 .

  • Фрэнк Дж. (2006). Трехмерная электронная микроскопия макромолекулярных ансамблей . Нью-Йорк: Издательство Оксфордского университета . ISBN 0-19-518218-9.
  • ван Хил М., Гоуэн Б., Матадин Р., Орлова Е. В., Финн Р., Пейп Т., Коэн Д., Старк Х., Шмидт Р., Шац М., Патвардхан А. (ноябрь 2000 г.). «Одночастичная электронная криомикроскопия: к атомному разрешению» . Ежеквартальные обзоры биофизики . 33 (4): 307–69. DOI : 10.1017 / s0033583500003644 . PMID  11233408 .

  • «ЭМ для чайников» . Проверено 9 июня 2006 года .
  • Тонкая структура замороженного вируса - сложная электронная криомикроскопия одной частицы выявляет беспрецедентные детали белковой оболочки вируса, Technology Review , 19 марта 2008 г.
  • Начало работы в Cryo-EM - онлайн-курс от Калифорнийского технологического института, профессор Грант Дженсен
  • Банк данных EM
  • EMstats Тенденции и распределения карт в EMDB, например тенденции разрешения