FLAG-метка , или октапептид FLAG , или эпитоп FLAG , представляет собой метку полипептидного белка, которая может быть добавлена к белку с использованием технологии рекомбинантной ДНК , имеющей мотив последовательности DYKDDDDK (где D = аспарагиновая кислота , Y = тирозин и K = лизин ) . [1] Это один из наиболее специфичных тегов [2], и это искусственный антиген, к которому были разработаны специфические высокоаффинные моноклональные антитела, и, следовательно, его можно использовать для очистки белков с помощью аффинной хроматографии, а также для определения местонахождения белков. внутри живых клеток. Он использовался для разделениярекомбинантный сверхэкспрессируемый белок из белка дикого типа, экспрессируемый организмом-хозяином. Его также можно использовать для выделения белковых комплексов с множеством субъединиц, поскольку его мягкая процедура очистки не разрушает такие комплексы. Он был использован для получения белков достаточной чистоты и качества для определения трехмерной структуры с помощью рентгеновской кристаллографии.
Тег FLAG можно использовать во многих различных анализах, которые требуют распознавания антителом . Если нет антитела против данного белка, добавление тега FLAG к белку позволяет исследовать белок с помощью антитела против последовательности FLAG. Примерами являются исследования клеточной локализации с помощью иммунофлуоресценции , иммунопреципитации или обнаружения электрофорезом белка в SDS-PAGE и вестерн-блоттингом.
Пептидная последовательность FLAG-метки от N-конца до C-конца: DYKDDDDK (1012 Да). Кроме того, его можно использовать в тандеме, обычно с пептидом 3xFLAG: DYKDHD-G-DYKDHD-I-DYKDDDDK (с последней меткой, кодирующей сайт расщепления энтерокиназой). Он может быть слит с С-концом или N-концом белка или вставлен в белок. Некоторые коммерчески доступные антитела (например, M1 / 4E11) распознают эпитоп только тогда, когда он присутствует на N-конце. Однако другие доступные антитела (например, M2) нечувствительны к положению. Остаток тирозина в FLAG-теге может быть сульфатирован , что может влиять на распознавание антителом эпитопа FLAG. [3] Тег FLAG может использоваться вместе с другими тегами аффинности, например, с полигистидиновым тегом ( His-tag ), HA-тегом или myc-тегом .
История
Первое использование метки эпитопа было описано Манро и Пелхамом в 1984 году. [4] ФЛАГ-метка была вторым примером полностью функциональной, улучшенной метки эпитопа, опубликованной в научной литературе. [1] [5] [6] и была единственной запатентованной меткой эпитопа. [7] [8] [9] С тех пор он стал наиболее часто используемой белковой меткой в лабораториях по всему миру. В отличие от некоторых других меток (например, myc, HA), где моноклональные антитела сначала выделяли против существующего белка, а затем эпитоп характеризовали и использовали в качестве метки, эпитоп FLAG представлял собой идеализированный, искусственный дизайн, к которому были выведены моноклональные антитела. . Структура тега FLAG была оптимизирована для совместимости с белками, к которым он прикреплен, в том смысле, что он более гидрофильный, чем другие распространенные теги эпитопа, и, следовательно, с меньшей вероятностью денатурирует или инактивирует белки, к которым он присоединен. Кроме того, N-концевые теги FLAG можно легко удалить с белков после их выделения путем обработки специфической протеазой, энтерокиназой ( энтеропептидазой ).
Третий отчет о маркировке эпитопа ( HA-tag ) [10] появился примерно через год после первой поставки системы Flag.
Смотрите также
Рекомендации
- ^ a b Хопп Т.П., Прикетт К.С., Прайс В.Л., Либби Р.Т., Марч С.Дж., Пэт Черретти Д., Урдал Д.Л., Конлон П.Дж. (1988). «Короткая последовательность маркера полипептида, полезная для идентификации и очистки рекомбинантного белка». Био / Технологии . 6 (10): 1204–10. DOI : 10.1038 / nbt1088-1204 . S2CID 205272216 .
- ^ «Куб Биотех» . Куб Биотех . Проверено 13 февраля 2020 .
- ^ Хантер М.Р., Гримси Н.Л., Гласс М. (2016). «На сульфатирование эпитопа FLAG влияет совместная экспрессия рецепторов, связанных с G-белком, в модели клеток млекопитающих» . Научные отчеты . 6 : 27316. Bibcode : 2016NatSR ... 627316H . DOI : 10.1038 / srep27316 . PMC 4895180 . PMID 27273047 .
- ^ Манро С., Пелхам Х.Р. (1984). «Использование пептидной маркировки для обнаружения белков, экспрессируемых из клонированных генов: делеционное картирование функциональных доменов Drosophila hsp 70» . Журнал EMBO . 3 (13): 3087–93. DOI : 10.1002 / j.1460-2075.1984.tb02263.x . PMC 557822 . PMID 6526011 .
- ^ Эйнхауэр А., Юнгбауэр А. (2001). «Пептид FLAG, универсальная гибридная метка для очистки рекомбинантных белков». Журнал биохимических и биофизических методов . 49 (1–3): 455–65. DOI : 10.1016 / S0165-022X (01) 00213-5 . PMID 11694294 .
- ^ «Добавление эпитопа к последовательности, кодирующей белок: FLAG-tag» . Логика молекулярных подходов к биологическим проблемам . Cornell University.
- ^ FLAG является зарегистрированным товарным знаком компании Sigma-Aldrich Co. LLC.
- ^ США предоставили 4703004 , Hopp TP, "Синтез белка с идентификационным пептидом (векторами)", выпущенный в 1987 году, переданный Immunex Corp.
- ^ «Эспаснет - результаты поиска» . world.espacenet.com . Проверено 15 января 20 .
- ^ Поле Дж., Никава Дж., Брук Д., Макдональд Б., Роджерс Л., Уилсон И.А., Лернер Р.А., Виглер М. (1988). «Очистка RAS-чувствительного комплекса аденилатциклазы из Saccharomyces cerevisiae с использованием метода добавления эпитопа» . Молекулярная и клеточная биология . 8 (5): 2159–65. DOI : 10.1128 / mcb.8.5.2159 . PMC 363397 . PMID 2455217 .