Фторо-нефритовое пятно
Окрашивание Fluoro-Jade представляет собой флуорохром , полученный из флуоресцеина , и обычно используется в нейробиологических дисциплинах для маркировки дегенерирующих нейронов в тканях ex vivo центральной нервной системы . О первом производном фторнефрита сообщил Ларри Шмуед в 1997 году в качестве альтернативного метода по сравнению с традиционными методами мечения дегенерирующих нейронов, таких как окрашивание нитратом серебра , окрашивание H&E или окрашивание по Нисслю . [1]Fluoro-Jade может быть предпочтительнее других дегенеративных красителей из-за простоты процедур окрашивания и визуальной интерпретации, которые являются общими недостатками обычных дегенеративных красителей. Однако механизм, с помощью которого фтор-нефрит метит дегенерирующие нейроны, неизвестен, что вызывает некоторые разногласия по поводу фактического физиологического состояния меченых клеток.
В настоящее время существует три фтор-нефритовых красителя (Fluoro-Jade, [1] Fluoro-Jade B, [2] и Fluoro-Jade C [3] ), все из которых являются анионными производными флуоресцеина и обладают высокой кислотностью . [3] В частности, Fluoro-Jade представляет собой смесь динатриевых солей 5-карбоксифлуоресцеина и 6-карбоксифлуоресцеина, тогда как Fluoro-Jade B представляет собой смесь (1) тринатриевого 5-(6-гидрокси-3-оксо-3H-ксантен- 9-ил)бензол, 1,2,4-трикарбоновая кислота, (2) динатриевая 2-(6-гидрокси-3-оксо-3H-ксантен-9ил)-5-(2,4-дигидроксибензол)терефталевая кислота и (3) динатрия 2,5-бис(6-гидрокси-3-оксо-3Н-ксантен-9ил)терефталевая кислота. [4] Все три вида фтор-нефрита имеют сходное возбуждение ипрофили эмиссии как флуоресцеин (возбуждение: 495 нм; эмиссия: 521 нм) и, таким образом, могут быть визуализированы с использованием фильтра флуоресцеин/FITC. Новые красители, фтор-нефрит B и фтор-нефрит C, были разработаны для улучшения отношения сигнал/шум, что позволило создать превосходные соединения для визуализации более тонкой морфологии нейронов, включая дендриты, аксоны и нервные окончания.
Почти все обработанные ткани совместимы с окрашиванием фтор-нефритом, включая ткани грызунов (мышей и крыс), приматов и людей. Смонтированную ткань ступенчато регидратируют уменьшающейся концентрацией спирта . Перманганат калия можно использовать для уменьшения фонового окрашивания и защиты ткани от выцветания и фотообесцвечивания. Fluoro-Jade хорошо растворяется в воде и поэтому сначала растворяется в дистиллированной воде . Чтобы быть специфичным для дегенерирующих нейронов, фтор-нефрит необходимо использовать в кислой среде, поэтому фтор-нефрит дополнительно разбавляют ледяной уксусной кислотой . Дополнительные промывки водой следует использовать для полоскания ткани перед сушкой и покровным стеклом. [1]
Процедуры окрашивания Fluoro-Jade являются гибкими и поэтому могут быть адаптированы для совместимости с другими методами окрашивания, такими как иммуногистохимия . Можно внести несколько модификаций в общие процедуры, например, уменьшить количество инкубаций с перманганатом калия, чтобы избежать нарушения иммунофлуоресцентной маркировки. Фон можно уменьшить с помощью альтернативных методов, таких как снижение температуры окрашивания или уменьшение концентрации Fluoro-Jade, которые могут быть более совместимы с другими методами мечения. [1] Такие изменения, однако, должны быть определены эмпирически, чтобы оптимизировать конкретные экспериментальные условия.
В дополнение к окрашиванию тканей пациентов, получавших лечение, следует включать положительные и отрицательные контроли, чтобы обеспечить специфичность и достоверность метода. Как правило, ткань от необработанных контрольных субъектов включается, чтобы показать специфичность в отношении дегенерирующих нейронов, поскольку фтор-нефрит не должен окрашивать недегенерирующие ткани. Кроме того, включен положительный контроль для обеспечения достоверности процедур окрашивания; чтобы показать, что дегенерирующие нейроны будут окрашиваться фтор-нефритом. Приемлемый положительный контроль включает нейродегенеративную ткань субъектов, у которых уже был подтвержден фтор-нефрит, например животных, получавших каиновую кислоту.
