Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

В молекулярном клонировании и биологии под ударом гена (аббревиатура: KI ) понимается метод генной инженерии, который включает однозначную замену информации о последовательности ДНК в генетическом локусе или вставку информации о последовательности, не обнаруженной в локусе. . [1] Обычно это делается на мышах, поскольку технология для этого процесса более усовершенствована и существует высокая степень сложности общих последовательностей между мышами и людьми. [2] Разница между технологией "нокаут" и традиционной трансгеннойМетоды состоят в том, что в нокаут вовлекается ген, вставленный в конкретный локус, и, таким образом, это «нацеленная» вставка. Это противоположность нокаута гена .

Обычное использование технологии подстановки - создание моделей болезней. Это метод, с помощью которого научные исследователи могут изучать функцию регуляторного аппарата (например, промоторов ), который управляет экспрессией заменяемого природного гена. Это достигается путем наблюдения за новым фенотипом рассматриваемого организма. В этом случае используются BAC и YAC , чтобы можно было передавать большие фрагменты.

Техника [ править ]

Нокаут генов возник как небольшая модификация оригинальной техники нокаута, разработанной Мартином Эвансом, Оливером Смитисом и Марио Капеччи. Традиционно, методы «нокаута» основывались на гомологичной рекомбинации для запуска целевой замены гена, хотя были разработаны другие методы, использующие опосредованную транспозоном систему для вставки целевого гена. [3] Использование loxPПримером этого являются фланкирующие сайты, которые вырезаются при экспрессии рекомбиназы Cre с генными векторами. Эмбриональные стволовые клетки с интересующей модификацией затем имплантируются в жизнеспособную бластоцисту, которая вырастет в зрелую химерную мышь с некоторыми клетками, имеющими генетическую информацию исходных клеток бластоцисты, и другими клетками, имеющими модификации, введенные в эмбриональные стволовые клетки. Последующее потомство химерной мыши будет иметь этот ген. [4]

Внедрение генов впервые позволило провести основанные на гипотезах исследования модификаций генов и полученных в результате фенотипов. Мутации в гене р53 человека, например, могут быть вызваны воздействием бензо (а) пирена (BaP), а мутированная копия гена р53 может быть вставлена ​​в геномы мышей. Опухоли легких, наблюдаемые у мышей с нокаутом, подтверждают гипотезу о канцерогенности BaP . [5] Более поздние разработки в технике «нокаута» позволили свиньям иметь ген зеленого флуоресцентного белка, вставленный с помощью системы CRISPR / Cas9 , что позволяет гораздо более точно и успешно вставлять гены. [6]Скорость включения гена, опосредованного CRISPR / Cas9, также позволяет генерировать двуаллельные модификации некоторых генов и фенотипа у мышей, наблюдаемого в одном поколении, в беспрецедентные сроки. [7]

Против нокаута гена [ править ]

Технология нокаута отличается от технологии нокаута тем, что технология нокаута направлена ​​либо на удаление части последовательности ДНК, либо на вставку нерелевантной информации о последовательности ДНК, чтобы нарушить экспрессию определенного генетического локуса. С другой стороны, технология вставки генов изменяет интересующий генетический локус посредством замены информации о последовательности ДНК один на один или путем добавления информации о последовательности, которая не обнаруживается в указанном генетическом локусе. Таким образом, нокаут гена можно рассматривать как усиление функциональной мутации, а нокаут гена - как потерю функциональной мутации, но нокаут гена может также включать замену функционального локуса гена на мутантный фенотип, что приводит к некоторой потере функции. [8]

Возможные приложения [ править ]

Благодаря успеху методов «нокаута» генов можно предвидеть множество клинических применений. Уже было показано, что введение участков гена иммуноглобулина человека в мышей позволяет им продуцировать гуманизированные антитела, которые являются терапевтически полезными. [9] Должна быть возможность модифицировать стволовые клетки человека для восстановления функции целевого гена в определенных тканях, например, возможно, корректировать мутантный ген гамма-цепи рецептора IL-2 в гемопоэтических стволовых клетках для восстановления развития лимфоцитов у людей с X -связанный тяжелый комбинированный иммунодефицит . [4]

Ограничения [ править ]

Несмотря на то, что технология подстановки генов оказалась мощным методом для создания моделей заболеваний человека и изучения белков in vivo , все еще существуют многочисленные ограничения. Многие из них совпадают с ограничениями технологии нокаута. Во-первых, комбинации нокаутных генов приводят к усложнению взаимодействий, которые встроенные гены и их продукты имеют с другими участками генома, и, следовательно, могут приводить к большему количеству побочных эффектов и трудно объяснимым фенотипам . Кроме того, только несколько локусов, таких как локус ROSA26, были охарактеризованы достаточно хорошо, чтобы их можно было использовать для условных нокаутов генов; составление комбинаций репортераи трансгены в одном и том же локусе проблематичны. Самым большим недостатком использования гена для создания модели заболевания человека является то, что физиология мышей не идентична физиологии человека, и человеческие ортологи белков, экспрессируемых у мышей, часто не полностью отражают роль гена в патологии человека. [10] Это можно увидеть на мышах, продуцируемых с мутацией фиброза ΔF508 в гене CFTR , который составляет более 70% мутаций в этом гене в человеческой популяции и приводит к муковисцидозу. Хотя мыши ΔF508 CF действительно демонстрируют дефекты обработки, характерные для человеческой мутации, они не проявляют легочных патофизиологических изменений, наблюдаемых у людей, и практически не несут легочного фенотипа. [11]Такие проблемы можно решить с помощью различных моделей животных, а модели свиней (легкие свиньи имеют много биохимических и физиологических сходств с легкими человека) были созданы в попытке лучше объяснить активность мутации ΔF508. [12]

См. Также [ править ]

  • Джин нокаут
  • Генная инженерия
  • Генетическая рекомбинация
  • Молекулярное клонирование
  • Плазмида
  • Вектор (молекулярная биология)

Ссылки [ править ]

  1. ^ Гибсон, Грег (2009). Учебник по геномной науке, 3-е изд . Сандерленд, Массачусетс: Синауэр. С. 301–302. ISBN 978-0-87893-236-8.
  2. ^ Консорциум по секвенированию генома мышей; Уотерстон, Роберт Х .; Линдблад-То, Керстин; Бирни, Юэн; Роджерс, Джейн; Abril, Josep F .; Агарвал, Панкадж; Агарвала, Рича; Эйнскау, Рэйчел (2002-12-05). «Первоначальное секвенирование и сравнительный анализ генома мыши» . Природа . 420 (6915): 520–562. Bibcode : 2002Natur.420..520W . DOI : 10,1038 / природа01262 . ISSN 0028-0836 . PMID 12466850 .  
  3. ^ Вестфаль, Швейцария; Ледер, П. (1997-07-01). «Генерируемые транспозоном конструкции для нацеливания на« нокаут »и« нокаут »для генов для использования на мышах». Текущая биология . 7 (7): 530–533. DOI : 10.1016 / s0960-9822 (06) 00224-7 . ISSN 0960-9822 . PMID 9210379 .  
  4. ^ a b Манис, Джон П. (2007-12-13). «Нокаутируй, сбивай, сбивай - генетически модифицированные мыши и Нобелевская премия». Медицинский журнал Новой Англии . 357 (24): 2426–2429. DOI : 10.1056 / NEJMp0707712 . ISSN 1533-4406 . PMID 18077807 .  
  5. ^ Лю, Чжипэй; Мюльбауэр, Карл-Рудольф; Schmeiser, Heinz H .; Хергенхан, Манфред; Белхаразем, Джеда; Холлштейн, Моника К. (1 апреля 2005 г.). «Мутации р53 в человеческих фибробластах, подвергнутых воздействию бензо (а) пирена, коррелируют с мутациями р53 в опухолях легких человека» . Исследования рака . 65 (7): 2583–2587. DOI : 10.1158 / 0008-5472.CAN-04-3675 . ISSN 0008-5472 . PMID 15805253 .  
  6. ^ Руань, Цзиньсюэ; Ли, Хэган; Сюй, Куи; Ву, Тяньвэнь; Вэй, Цзинлян; Чжоу, Ронг; Лю, Чжиго; Му, Юлиан; Ян, Шулин (2015-09-18). «Высокоэффективный CRISPR / Cas9-опосредованный нокин трансгена в локусе H11 у свиней» . Научные отчеты . 5 : 14253. Bibcode : 2015NatSR ... 514253R . DOI : 10.1038 / srep14253 . PMC 4585612 . PMID 26381350 .  
  7. ^ Ван, Яньлянь; Ли, Цзюньхун; Сян, Цзиньчжу; Вэнь, Бинцян; Му, Хайюань; Чжан, Вэй; Хан, Цзяньюн (10 декабря 2015 г.). «Высокоэффективное создание двуаллельного репортерного гена у мышей с помощью CRISPR-опосредованного редактирования генома ESC» . Белки и клетки . 7 (2): 152–156. DOI : 10.1007 / s13238-015-0228-3 . ISSN 1674-800X . PMC 4742388 . PMID 26661644 .   
  8. ^ Дойл, Альфред; МакГарри, Майкл П .; Ли, Нэнси А .; Ли, Джеймс Дж. (2012-04-01). «Построение трансгенных и генных моделей нокаутных / нокаутных мышей болезней человека» . Трансгенные исследования . 21 (2): 327–349. DOI : 10.1007 / s11248-011-9537-3 . ISSN 0962-8819 . PMC 3516403 . PMID 21800101 .   
  9. ^ Бенатуил, Лоренцо; Кэй, Джоэл; Кретин, Натали; Годвин, Джонатан Дж .; Кариаппа, Аннаия; Пиллай, Шив; Якомини, Джон (2008-03-15). «Мыши с нокаутом Ig, продуцирующие анти-углеводные антитела: прорыв В-клеток, продуцирующих низкоаффинные анти-собственные антитела» . Журнал иммунологии . 180 (6): 3839–3848. DOI : 10.4049 / jimmunol.180.6.3839 . ISSN 0022-1767 . PMID 18322191 .  
  10. ^ Tellkamp, ​​Фредерик; Бенхаду, Фарида; Бремер, Йерун; Гнарра, Мария; Knüver, Jana; Шаффенрат, Сандра; Ворхаген, Сюзанна (01.12.2014). «Технология трансгенных мышей в биологии кожи: создание мышей с нокаутом» . Журнал следственной дерматологии . 134 (12): 1–3. DOI : 10.1038 / jid.2014.434 . ISSN 1523-1747 . PMID 25381772 .  
  11. ^ Грабб, Барбара Р .; Баучер, Ричард К. (1999-01-01). "Патофизиология генно-ориентированных моделей мышей для муковисцидоза". Физиологические обзоры . 79 (1): S193 – S214. DOI : 10.1152 / Physrev.1999.79.1.S193 . ISSN 0031-9333 . PMID 9922382 .  
  12. ^ Роджерс, Кристофер С .; Хао, Яньхун; Рохлина, Татьяна; Самуэль, Мелисса; Штольц, Дэвид А .; Ли, Юхонг; Петров, Елена; Vermeer, Daniel W .; Кабель, Аманда С. (1 апреля 2008 г.). «Продукция CFTR-нулевых и CFTR-DeltaF508 гетерозиготных свиней путем нацеливания на аденоассоциированный вирус и перенос ядер соматических клеток» . Журнал клинических исследований . 118 (4): 1571–1577. DOI : 10.1172 / JCI34773 . ISSN 0021-9738 . PMC 2265103 . PMID 18324337 .   

Внешние ссылки [ править ]

  • Генетические методы, техники и протоколы
  • Институт Коха интегративных исследований рака в Массачусетском технологическом институте: нокауты и нокауты
  • UMass Profiles Research Networking Software: Gene Knock-In Techniques - программный инструмент для создания сетей и анализа экспертных знаний.
  • http://www.transgenic.co.jp/en/products/mice-service/modified_mouse/knockin.php - описывает процесс построения векторов вставки и разведения мышей