Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Некоторые этапы разработки метаболического процесса

Метаболическая инженерия - это практика оптимизации генетических и регуляторных процессов в клетках с целью увеличения производства клетками определенного вещества. Эти процессы представляют собой химические сети, которые используют серию биохимических реакций и ферментов, которые позволяют клеткам преобразовывать сырье в молекулы, необходимые для выживания клетки. Метаболическая инженерия, в частности, стремится математически смоделировать эти сети, рассчитать выход полезных продуктов и точно определить части сети, которые ограничивают производство этих продуктов. [1] Генная инженериязатем можно использовать методы для модификации сети, чтобы снять эти ограничения. И снова эта модифицированная сеть может быть смоделирована для расчета выхода нового продукта.

Конечная цель метаболической инженерии - иметь возможность использовать эти организмы для производства ценных веществ в промышленных масштабах рентабельным способом. Текущие примеры включают производство пива , вина , сыра , фармацевтических препаратов и других биотехнологических продуктов. [2] Некоторые из распространенных стратегий, используемых для метаболической инженерии: (1) сверхэкспрессия гена, кодирующего ограничивающий скорость фермент пути биосинтеза, (2) блокирование конкурирующих метаболических путей, (3) экспрессия гетерологичного гена и (4) ферментная инженерия. [3]

Поскольку клетки используют эти метаболические сети для своего выживания, изменения могут сильно повлиять на жизнеспособность клеток. Следовательно, в метаболической инженерии возникает компромисс между способностью клеток производить желаемое вещество и их естественными потребностями в выживании. Следовательно, вместо прямого удаления и / или сверхэкспрессии генов, кодирующих метаболические ферменты, в настоящее время основное внимание уделяется нацеливанию на регуляторные сети в клетке, чтобы эффективно спроектировать метаболизм. [4]

История и приложения [ править ]

Клеточный метаболизм можно оптимизировать для промышленного использования.

В прошлом, чтобы увеличить продуктивность желаемого метаболита , микроорганизм был генетически модифицирован путем химически индуцированной мутации , а затем был выбран мутантный штамм, который сверхэкспрессировал желаемый метаболит. [5] Однако одна из основных проблем этого метода заключалась в том, что метаболический путь производства этого метаболита не был проанализирован, и в результате были неизвестны ограничения на производство и соответствующие ферменты пути, которые должны были быть изменены. [5]

В 1990-х годах появилась новая техника, называемая метаболической инженерией. Этот метод анализирует метаболический путь микроорганизма и определяет ограничения и их влияние на производство желаемых соединений. Затем он использует генную инженерию для снятия этих ограничений. Вот некоторые примеры успешной метаболической инженерии: (i) Выявление ограничений для производства лизина в Corynebacterium glutamicum и внедрение новых генов для снятия этих ограничений с целью улучшения производства [6] (ii) Разработка нового пути биосинтеза жирных кислот , называемого обратное бета-окислениепуть, который более эффективен, чем естественный путь производства жирных кислот и спиртов, которые потенциально могут быть каталитически преобразованы в химические вещества и топливо [7] (iii) Улучшенное производство DAHP , ароматического метаболита, продуцируемого E. coli, который является промежуточным звеном в производство ароматических аминокислот. [8] Путем анализа метаболического потока было определено, что теоретический максимальный выход DAHP на одну используемую молекулу глюкозы составлял 3/7. Это связано с тем, что часть углерода из глюкозы теряется в виде диоксида углерода вместо того, чтобы использоваться для производства DAHP. Кроме того, один из метаболитов (PEP или фосфоенолпируват ), которые используются для производства DAHP, превращался в пируват.(PYR) для транспортировки глюкозы в клетку и, следовательно, больше не был доступен для производства DAHP. Чтобы уменьшить нехватку PEP и повысить урожайность, Patnaik et al. использовали генную инженерию на E. coli, чтобы ввести реакцию, которая превращает PYR обратно в PEP. Таким образом, PEP, используемый для транспортировки глюкозы в клетку, регенерируется и может использоваться для производства DAHP. Это привело к новому теоретическому максимальному выходу 6/7 - вдвое больше, чем у нативной системы E. coli .

В промышленных масштабах метаболическая инженерия становится более удобной и рентабельной. По данным Организации биотехнологической промышленности , « в Северной Америке строится более 50 объектов биопереработки, чтобы применить метаболическую инженерию для производства биотоплива и химикатов из возобновляемой биомассы, которые могут помочь сократить выбросы парниковых газов». Возможные виды биотоплива включают короткоцепочечные спирты и алканы (для замены бензина ), метиловые эфиры жирных кислот и жирные спирты (для замены дизельного топлива ), а также биотопливо на основе жирных кислот и изопреноидов (для замены дизельного топлива).). [9]

Метаболическая инженерия продолжает развиваться по эффективности и процессам, чему способствуют прорывы в области синтетической биологии и прогресс в понимании повреждения метаболитов и его восстановления или упреждения . Ранние эксперименты по метаболической инженерии показали, что накопление реактивных промежуточных продуктов может ограничивать поток в сконструированных путях и быть вредным для клеток-хозяев, если соответствующие системы контроля повреждений отсутствуют или неадекватны. [10] [11] Исследователи синтетической биологии оптимизируют генетические пути, которые, в свою очередь, влияют на метаболизм клеток. Недавнее снижение стоимости синтезированной ДНК и развитие генетических схемпомочь повлиять на способность метаболической инженерии производить желаемые результаты. [12]

Анализ метаболического потока [ править ]

Анализ метаболического потока можно найти в разделе Анализ баланса потоков.

Настройка метаболического пути для анализа [ править ]

Первым шагом в этом процессе является определение желаемой цели, которую необходимо достичь путем улучшения или модификации метаболизма организма. Справочники и онлайн-базы данных используются для исследования реакций и метаболических путей, которые могут привести к появлению этого продукта или результата. Эти базы данных содержат обширную геномную и химическую информацию, включая пути метаболизма и другие клеточные процессы. С помощью этого исследования выбирается организм, который будет использоваться для создания желаемого продукта или результата. При принятии этого решения учитываются следующие соображения: насколько близок метаболический путь организма к желаемому пути, затраты на обслуживание, связанные с организмом, и насколько легко изменить путь организма. Escherichia coli ( кишечная палочка) широко используется в метаболической инженерии для синтеза широкого спектра продуктов, таких как аминокислоты, поскольку его относительно легко поддерживать и модифицировать. [13] Если организм не содержит полного пути получения желаемого продукта или результата, то гены, которые производят недостающие ферменты, должны быть включены в организм.

Анализ метаболического пути [ править ]

Завершенный метаболический путь моделируется математически, чтобы определить теоретический выход продукта или потоки реакции в клетке. Поток - это скорость, с которой происходит данная реакция в сети. Простой анализ метаболических путей может быть выполнен вручную, но большинство из них требует использования программного обеспечения для выполнения вычислений. [14] Эти программы используют сложные алгоритмы линейной алгебры для решения этих моделей. Чтобы решить сеть с использованием уравнения для определенных систем, показанного ниже, необходимо ввести необходимую информацию о соответствующих реакциях и их потоках. Информация о реакции (такая как реагенты и стехиометрия) содержится в матрицах G x и G m . Матрицы V m и V xсодержат потоки соответствующих реакций. После решения уравнение дает значения всех неизвестных потоков (содержащихся в V x ).

Определение оптимальных генетических манипуляций [ править ]

После определения потоков реакций в сети необходимо определить, какие реакции могут быть изменены, чтобы максимизировать выход желаемого продукта. Чтобы определить, какие именно генетические манипуляции выполнять, необходимо использовать вычислительные алгоритмы, такие как OptGene или OptFlux. [15]Они дают рекомендации относительно того, какие гены следует сверхэкспрессировать, нокаутировать или ввести в клетку, чтобы увеличить производство желаемого продукта. Например, если данная реакция имеет особенно низкий поток и ограничивает количество продукта, программное обеспечение может рекомендовать сверхэкспрессию фермента, катализирующего эту реакцию, в клетке для увеличения потока реакции. Необходимые генетические манипуляции могут быть выполнены с использованием стандартных методов молекулярной биологии. Гены могут быть сверхэкспрессированы или выбиты из организма, в зависимости от их влияния на путь и конечную цель. [16]

Экспериментальные измерения [ править ]

Чтобы создать решаемую модель, часто необходимо иметь определенные потоки, уже известные или измеренные экспериментально. Кроме того, чтобы проверить влияние генетических манипуляций на метаболическую сеть (чтобы убедиться, что они совпадают с моделью), необходимо экспериментально измерить потоки в сети. Чтобы измерить потоки реакции, измерения потока углерода производятся с использованием изотопной метки углерода-13 . [17]Организм питается смесью, которая содержит молекулы, в которых атомы углерода сконструированы так, чтобы состоять из атомов углерода-13, а не углерода-12. После того, как эти молекулы используются в сети, последующие метаболиты также становятся меченными углеродом-13, поскольку они включают эти атомы в свои структуры. Специфический паттерн маркировки различных метаболитов определяется реакционными потоками в сети. Образцы маркировки могут быть измерены с использованием таких методов, как газовая хроматография-масс-спектрометрия (ГХ-МС), наряду с вычислительными алгоритмами для определения потоков реакции.

См. Также [ править ]

  • Бактериальная трансформация
  • Биореактор
  • Генная инженерия
  • Синтетический биологический контур
  • Синтетическая биология

Ссылки [ править ]

  1. ^ Ян, YT, Беннеты, GN, Сан, KY, (1998) Генетические и метаболическая инженерия , Электронный журнал биотехнология, ISSN  0717-3458
  2. ^ Н. Милн, П. Томсен, Н. Мёльгаард Кнудсен, П. Рубашка, М. Кристенсен, Л. Бородина (2020-07-01). «Метаболическая инженерия Saccharomyces cerevisiae для производства de novo псилоцибина и родственных производных триптамина» . Метаболическая инженерия . 60 : 25–36. DOI : 10.1016 / j.ymben.2019.12.007 . ISSN 1096-7176 . CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  3. ^ Kulkarni R, 2016. Метаболическая инженерия: биологическое искусство производства полезных химических веществ . Резонанс, 21 (3), 233-237.
  4. ^ Вемури, GM, Аристиду, AA, (2005) Метаболическая инженерия в эру -omics: выяснение и модулирование регуляторных сетей , Обзор Microbial Mol Biology, том. 69: 197-216
  5. ^ a b Войт, Эберхард, Торрес, Нестор В. (2002). «Анализ и оптимизация путей в метаболической инженерии». Кембридж: University Press, p.ix-x
  6. Перейти ↑ Stephanopoulos, GN, Aristidou, AA, Nielsen, J. (1998). «Метаболическая инженерия: принципы и методологии». Сан-Диего: Academic Press
  7. ^ Dellomonaco, Клементина. (2011). Спроектированная реверсия цикла бета-окисления для синтеза топлива и химикатов. Природа 476,355-359
  8. ^ Patnaik, Р. и Liao, J. (1994). «Разработка центрального метаболизма Escherichia coli для производства ароматических метаболитов с почти теоретическим выходом». Appl. Environ. Microbiol. 60 (11): 3903-3908
  9. ^ Кислинг Д., Джей (2010). Передовое производство биотоплива с помощью микробов. Biotechnol.J., 5,147-162
  10. ^ Мартин, Винсент JJ; Pitera, Douglas J .; Холка, Сиднор Т .; Ньюман, Джек Д .; Кислинг, Джей Д. (01.07.2003). «Разработка мевалонатного пути в Escherichia coli для производства терпеноидов». Природа Биотехнологии . 21 (7): 796–802. DOI : 10.1038 / nbt833 . ISSN 1087-0156 . PMID 12778056 .  
  11. ^ Withers, Sydnor T .; Gottlieb, Shayin S .; Лье, Бонни; Ньюман, Джек Д .; Кислинг, Джей Д. (2007-10-01). «Идентификация генов биосинтеза изопентенола из Bacillus subtilis с помощью метода скрининга, основанного на токсичности предшественников изопреноидов» . Прикладная и экологическая микробиология . 73 (19): 6277–6283. DOI : 10,1128 / AEM.00861-07 . ISSN 0099-2240 . PMC 2075014 . PMID 17693564 .   
  12. ^ Стефанопулос, Грегори (2012-11-16). «Синтетическая биология и метаболическая инженерия». Синтетическая биология ACS . 1 (11): 514–525. DOI : 10.1021 / sb300094q . PMID 23656228 . 
  13. ↑ Калифорнийский университет - Лос-Анджелес (18 декабря 2008 г.). «Генетическая модификация превращает бактерии E. Coli в биотопливо высокой плотности». ScienceDaily. Получено 7 декабря 2011 г. с https://www.sciencedaily.com/releases/2008/12/081218151652.htm.
  14. ^ Schellenberger, J., Que, R., Fleming, R., et al. (2011). «Количественное прогнозирование клеточного метаболизма с помощью моделей на основе ограничений: COBRA Toolbox v2.0». Протоколы природы. 6 (9): 1290-1307
  15. ^ Роча, И., Майя, П., Евангелиста, П. и др. (2010). «OptFlux: программная платформа с открытым исходным кодом для метаболической инженерии in silico». BMC Sys Biol. 45 (4)
  16. ^ Ворк, Т.С., Хинтон, Р., Уорк, Э., Доброта, М., Чард, Т. (1980). «Лабораторные методы в биохимии и молекулярной биологии». v.8
  17. ^ ВИХЕРТ, У. и де Грааф, А. (2000). «Шаги двунаправленной реакции в метаболических сетях: моделирование и моделирование экспериментов по маркировке изотопов углерода». Biotechnol. Bioeng. 55 (1): 101-117

Внешние ссылки [ править ]

Веб-сайт Организации биотехнологической промышленности (BIO):

  • BIO веб-сайт