Из Википедии, свободной энциклопедии
  (Перенаправлено с Нозерн-блоттинга )
Перейти к навигации Перейти к поиску
Блок-схема, описывающая общую процедуру обнаружения РНК с помощью нозерн-блоттинга.

Нозерн - блот , или РНК - блот, [1] это метод , используемый в молекулярной биологии исследований для изучения экспрессии генов путем детекции РНК (или изолированных мРНК ) в образце. [2] [3]

С помощью Нозерн-блоттинга можно наблюдать клеточный контроль над структурой и функцией, определяя частоту экспрессии конкретных генов во время дифференцировки и морфогенеза , а также в аномальных или болезненных условиях. [4] Нозерн-блоттинг включает использование электрофореза для разделения образцов РНК по размеру и обнаружение гибридизационным зондом, комплементарным части или всей целевой последовательности. Термин «нозерн-блот» на самом деле относится конкретно к капиллярному переносу РНК из геля для электрофореза на мембрану для блоттинга. Однако весь процесс обычно называют Нозерн-блоттингом. [5] Метод Нозерн-блоттинга был разработан в 1977 году Джеймсом Олвином,Дэвид Кемп и Джордж Старк в Стэнфордском университете , [6] с вкладами от Gerhard Heinrich. Нозерн-блоттинг получил свое название от сходства с первым методом блоттинга - саузерн-блоттингом , названным в честь биолога Эдвина Саузерна . [2] Основное различие состоит в том, что в Нозерн-блоте анализируется скорее РНК, чем ДНК . [7]

Процедура [ править ]

Общая процедура блоттинга [5] начинается с извлечения общей РНК из гомогенизированного образца ткани или из клеток. Затем эукариотическая мРНК может быть выделена с помощью хроматографии на олиго (dT) целлюлозе для выделения только тех РНК с поли (A) хвостом . [8] [9] Затем образцы РНК разделяют гель-электрофорезом. Поскольку гели хрупкие и зонды не могут проникнуть в матрицу, образцы РНК, теперь разделенные по размеру, переносятся на нейлоновую мембрану через капиллярную или вакуумную систему блоттинга.

Установка системы капиллярного блоттинга для переноса РНК из геля для электрофореза на мембрану для блоттинга.

Нейлоновая мембрана с положительным зарядом является наиболее эффективной для использования в Нозерн-блоттинге, поскольку отрицательно заряженные нуклеиновые кислоты обладают высоким сродством к ним. Буфер для переноса, используемый для блоттинга, обычно содержит формамид, поскольку он снижает температуру отжига взаимодействия зонд-РНК, тем самым устраняя необходимость в высоких температурах, которые могут вызвать деградацию РНК. [10] После того, как РНК была перенесена на мембрану, она иммобилизуется посредством ковалентной связи с мембраной под действием УФ-света или тепла. После того, как зонд был помечен, он гибридизируется с РНК на мембране. Экспериментальные условия, которые могут влиять на эффективность и специфичность гибридизации, включают ионную силу, вязкость, длину дуплекса, несовпадающие пары оснований и состав оснований.[11] Мембрана промывается, чтобы гарантировать специфическое связывание зонда и предотвратить возникновение фоновых сигналов. Затем гибридные сигналы обнаруживаются с помощью рентгеновской пленки и могут быть количественно определены денситометрией . Для создания контролей для сравнения в Нозерн-блоте образцы, не отображающие интересующий генный продукт, можно использовать после определения с помощью микрочипов или ОТ-ПЦР . [11]

Гели [ править ]

РНК проходит на формальдегидном агарозном геле, чтобы выделить 28S (верхняя полоса) и 18S (нижняя полоса) рибосомные субъединицы.

Образцы РНК чаще всего разделяют на агарозных гелях, содержащих формальдегид в качестве денатурирующего агента для РНК, ограничивающего вторичную структуру. [11] [12] Гели можно окрашивать бромистым этидием (EtBr) и рассматривать в ультрафиолетовом свете, чтобы оценить качество и количество РНК перед блоттингом. [11] Электрофорез в полиакриламидном геле с мочевиной также можно использовать для разделения РНК, но чаще всего он используется для фрагментированных РНК или микроРНК. [13] РНК-лестницу часто проводят рядом с образцами на геле для электрофореза, чтобы наблюдать размер полученных фрагментов, но в образцах общей РНК субъединицы рибосом могут действовать как маркеры размера.[11] Поскольку большая рибосомная субъединица - это 28S (приблизительно 5kb), а малая рибосомная субъединица - это 18S (приблизительно 2kb), на геле появляются две заметные полосы, большая, почти в два раза интенсивнее меньшей. [11] [14]

Зонды [ править ]

Зонды для нозерн-блоттинга состоят из нуклеиновых кислот с последовательностью, комплементарной для всей или части интересующей РНК, они могут быть ДНК, РНК или олигонуклеотидами с минимум 25 основаниями, комплементарными целевой последовательности. [5] РНК-зонды (рибозонды), которые транскрибируются in vitro, способны выдерживать более строгие этапы промывки, предотвращая некоторый фоновый шум. [11] Обычно кДНК создают с помощью меченых праймеров для интересующей последовательности РНК, чтобы действовать как зонд в Нозерн-блоте. [15] Зонды должны быть помечены радиоактивными изотопами ( 32 P) или хемилюминесценцией, в которой щелочная фосфатаза или пероксидаза хрена(HRP) разрушают хемилюминесцентные субстраты, производя заметное излучение света. [16] Хемилюминесцентное мечение может происходить двумя способами: либо зонд присоединяется к ферменту, либо зонд метят лигандом (например, биотином ), лиганд (например, авидин или стрептавидин ) присоединен к ферменту ( например, HRP). [11] Рентгеновская пленка может обнаруживать как радиоактивные, так и хемилюминесцентные сигналы, и многие исследователи предпочитают хемилюминесцентные сигналы, потому что они быстрее, более чувствительны и уменьшают опасность для здоровья, связанную с радиоактивными метками. [16] Одну и ту же мембрану можно исследовать до пяти раз без значительной потери целевой РНК.[10]

Приложения [ править ]

Нозерн-блоттинг позволяет наблюдать характер экспрессии определенного гена между тканями, органами, стадиями развития, уровнями экологического стресса, инфекцией патогенов и в ходе лечения. [9] [15] [17] Этот метод использовался, чтобы показать сверхэкспрессию онкогенов и подавление генов-супрессоров опухолей в раковых клетках по сравнению с «нормальной» тканью, [11] а также экспрессию генов в отторжении пересаженные органы. [18] Если повышенная регуляция гена наблюдается по обилию мРНК на Нозерн-блоте, образец может быть секвенирован, чтобы определить, известен ли ген исследователям или это новое открытие. [18] Паттерны экспрессии, полученные в данных условиях, могут дать представление о функции этого гена. Поскольку РНК сначала разделяется по размеру, если используется только один тип зонда, разница в уровне каждой полосы на мембране может дать представление о размере продукта, предлагая альтернативные продукты сплайсинга одного и того же гена или повторяющиеся мотивы последовательностей. [8] [14] Различия в размере продукта гена также могут указывать на делеции или ошибки в обработке транскриптов. Изменяя зонд-мишень, используемый вдоль известной последовательности, можно определить, какая область РНК отсутствует. [2]

Преимущества и недостатки [ править ]

Анализ экспрессии генов может быть выполнен несколькими различными методами, включая ОТ-ПЦР, анализы защиты от РНКаз, микроматрицы, RNA-Seq , серийный анализ экспрессии генов (SAGE), а также нозерн-блоттинг. [4] [5] Микроматрицы используются довольно часто и обычно согласуются с данными, полученными с помощью Нозерн-блотов; однако иногда нозерн-блоттинг может обнаружить небольшие изменения в экспрессии генов, которые не могут быть обнаружены с помощью микрочипов. [19] Преимущество микроматриц перед нозерн-блоттингом состоит в том, что одновременно можно визуализировать тысячи генов, в то время как нозерн-блоттинг обычно рассматривает один или небольшое количество генов. [17] [19]

Проблема в северном блоттинга часто образец деградация с помощью РНКазов (как эндогенная к образцу и через загрязнение окружающей среды), в котором можно избежать пути надлежащей стерилизации стеклянной посуды и применением ингибиторов РНКазов , такие как DEPC ( диэтилпирокарбонат ). [5] Химические вещества, используемые в большинстве северных пятен, могут представлять опасность для исследователя, поскольку формальдегид, радиоактивный материал, бромид этидия, DEPC и УФ-свет вредны при определенных воздействиях. [11] По сравнению с ОТ-ПЦР, Нозерн-блоттинг имеет низкую чувствительность, но он также имеет высокую специфичность, что важно для уменьшения количества ложноположительных результатов. [11]

Преимущества использования Нозерн-блоттинга включают определение размера РНК, наблюдение за альтернативными продуктами сплайсинга, использование зондов с частичной гомологией, качество и количество РНК можно измерить на геле до блоттинга, а мембраны можно хранить. и осуждался годами после промокания. [11]

Для Нозерн-блоттинга для обнаружения мРНК ацетилхолинэстеразы нерадиоактивный метод сравнивали с радиоактивным, и было обнаружено, что он такой же чувствительный, как и радиоактивный, но не требует защиты от излучения и занимает меньше времени. [20]

Обратное северное пятно [ править ]

Иногда исследователи используют вариант процедуры, известный как обратный нозерн-блот. В этой процедуре нуклеиновая кислота субстрата (которая прикреплена к мембране) представляет собой набор изолированных фрагментов ДНК, а зонд представляет собой РНК, извлеченную из ткани и радиоактивно помеченную. Использование ДНК-микрочипов, которые получили широкое распространение в конце 1990-х - начале 2000-х годов, больше похоже на обратную процедуру, поскольку они включают использование изолированных фрагментов ДНК, прикрепленных к субстрату, и гибридизацию с зондом, изготовленным из клеточной РНК. . Таким образом, обратная процедура, хотя изначально необычная, позволила северному анализу развиться в профилирование экспрессии генов , при котором можно отслеживать экспрессию многих (возможно, всех) генов в организме.

См. Также [ править ]

  • Вестерн-блоттинг
  • Восточная клякса
  • Северо-западное пятно
  • Дальневосточная клякса
  • Дальневосточный блот
  • Дифференциальный дисплей

Ссылки [ править ]

  1. ^ Гилберт, SF (2000) Биология развития, 6-е изд. Сандерленд, Массачусетс, Sinauer Associates.
  2. ^ a b c Альбертс, Б., Джонсон, А., Льюис, Дж. Рафф, М., Робертс, К., Уолтер, П. 2008. Молекулярная биология клетки, 5-е изд. Garland Science, Taylor & Francis Group, NY, стр. 538–539.
  3. ^ Kevil, CG, Уолш Л., Laroux, FS, Kalogeris Т., Гришэм, MB, Александр, JS (1997) Усовершенствованный, Rapid Северный протокол. Биохим. и Biophys. Research Comm. 238: 277–279.
  4. ^ a b Schlamp, K .; Weinmann, A .; Крупп, М .; Maass, T .; Галле, PR; Тойфель, А. (2008). «BlotBase: база данных Нозерн-блотов». Джин . 427 (1-2): 47-50. DOI : 10.1016 / j.gene.2008.08.026 . PMID  18838116 .
  5. ^ a b c d e Трейхурн, П. (1996) Нозерн-блоттинг. Pro. Nutrition Soc. 55: 583–589.
  6. ^ Alwine JC, Кемп DJ, Stark GR (1977). «Метод обнаружения специфических РНК в агарозных гелях путем переноса на диазобензилоксиметилбумагу и гибридизации с ДНК-зондами» . Proc. Natl. Акад. Sci. США . 74 (12): 5350–4. DOI : 10.1073 / pnas.74.12.5350 . PMC 431715 . PMID 414220 .  
  7. ^ Бор, YC; Swartz, J .; Li, Y .; Coyle, J .; Рекош, Д .; Хаммаршельд, Мария-Луиза (2006). «Нозерн-блоттинг мРНК из полирибосом млекопитающих». Протоколы природы . DOI : 10.1038 / nprot.2006.216 .
  8. ^ а б Дюран, GM; Зукин, RS (1993). «Регуляция развития мРНК, кодирующих рецепторы Kainate / AMPA мозга крысы: исследование северного анализа». J. Neurochem . 61 (6): 2239–2246. DOI : 10.1111 / j.1471-4159.1993.tb07465.x . PMID 8245974 . 
  9. ^ a b Mori, H .; Takeda-Yoshikawa, Y .; Хара-Нисимура, I .; Нисимура, М. (1991). «Клонирование малатсинтазы тыквы и секвенирование кДНК и Нозерн-блоттинг». Евро. J. Biochem . 197 (2): 331–336. DOI : 10.1111 / j.1432-1033.1991.tb15915.x . PMID 1709098 . 
  10. ^ a b Ян, H .; McLeese, J .; Weisbart, M .; Dionne, J.-L .; Lemaire, I .; Обен, РА (1993). «Упрощенный протокол высокой пропускной способности для северной гибридизации» . Исследования нуклеиновых кислот . 21 (14): 3337–3338. DOI : 10.1093 / NAR / 21.14.3337 . PMC 309787 . PMID 8341618 .  
  11. ^ a b c d e f g h i j k l Streit, S .; Михальский, CW; Эркан, М .; Kleef, J .; Фрисс, Х. (2009). «Нозерн-блоттинг для обнаружения РНК в клетках и тканях рака поджелудочной железы». Протоколы природы . 4 (1): 37–43. DOI : 10.1038 / nprot.2008.216 . PMID 19131955 . 
  12. ^ Яманака, S .; Поксай, КС; Арнольд, KS; Innerarity, TL (1997). «Новая мРНК репрессора трансляции широко редактируется в печени, содержащей опухоли, вызванные экспрессией трансгена фермента редактирования мРНК апоВ» . Genes Dev . 11 (3): 321–333. DOI : 10,1101 / gad.11.3.321 . PMID 9030685 . 
  13. ^ Valoczi, A., Hornyik, C., Varga, N., Burgyan, J., Kauppinen, S., Havelda, Z. (2004) Чувствительное и специфическое обнаружение микроРНК методом нозерн-блоттинга с использованием LNA-модифицированных олигонуклеотидных зондов. Nuc. Исследования кислот. 32: e175.
  14. ^ а б Гортнер, Г .; Pfenninger, M .; Kahl, G .; Вайзинг, К. (1996). «Нозерн-блоттинг простой повторяющейся транскрипции последовательности в растениях». Электрофорез . 17 (7): 1183–1189. DOI : 10.1002 / elps.1150170702 . PMID 8855401 . 
  15. ^ a b Liang, P. Pardee, AB (1995) Последние достижения в области дифференциального отображения. Current Opinion Immunol. 7: 274–280.
  16. ^ a b Engler-Blum, G .; Meier, M .; Франк, Дж .; Мюллер, Джорджия (1993). «Уменьшение фоновых проблем при нерадиоактивном Нозерн-блоттинге и Саузерн-блоттинге обеспечивает более высокую чувствительность, чем гибридизации на основе 32P». Анальный. Биохим . 210 (2): 235–244. DOI : 10.1006 / abio.1993.1189 . PMID 7685563 . 
  17. ^ a b Болдуин, Д., Крейн, В., Райс, Д. (1999) Сравнение гелевых, нейлоновых фильтров и методов микроматрицы для обнаружения дифференциальной экспрессии РНК в растениях. Current Opinion in Plant Biol. 2: 96–103.
  18. ^ a b Utans, U .; Liang, P .; Wyner, LR; Карновский, MJ; Рассел, Мэн (1994). «Хроническое сердечное отторжение: идентификация пяти активированных генов в трансплантированных сердцах с помощью дифференциального отображения мРНК» . Proc. Natl. Акад. Sci. США . 91 (14): 6463–6467. DOI : 10.1073 / pnas.91.14.6463 . PMC 44222 . PMID 8022806 .  
  19. ^ a b Танигучи, М .; Миура, К .; Iwao, H .; Яманака, С. (2001). «Количественная оценка микрочипов ДНК - сравнение с нозерн-блоттингом». Геномика . 71 (1): 34–39. DOI : 10.1006 / geno.2000.6427 . PMID 11161795 . 
  20. ^ Крефт, К., Крефт, С., Комел, Р., Grubič, Z. (2000). Нерадиоактивный нозерн-блоттинг для определения мРНК ацетилхолинэстеразы. Арка Пфлюгера - Eur J Physiol, 439: R66-R67

Внешние ссылки [ править ]

Ресурсы библиотеки о
Нозерн-блоте
  • Ресурсы в вашей библиотеке
  • Ресурсы в других библиотеках
  • OpenWetWare