Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
«НААТ» перенаправляется сюда. Его не следует путать с наат , наат (деревня) или наат (значения) .
Ротавирус

Тест на нуклеиновую кислоту ( NAT ) - это метод, используемый для обнаружения определенной последовательности нуклеиновой кислоты и, следовательно, обычно для обнаружения и идентификации определенного вида или подвида организма, часто вируса или бактерий, которые действуют как патоген в крови , тканях , моче , и т. д. NAT отличаются от других тестов тем, что они обнаруживают генетический материал ( РНК или ДНК ), а не антигены или антитела.. Обнаружение генетических материалов позволяет на ранней стадии диагностировать заболевание, поскольку для обнаружения антигенов и / или антител требуется время, чтобы они начали появляться в кровотоке. [1] Поскольку количество определенного генетического материала обычно очень мало, многие NAT включают этап, который усиливает генетический материал, то есть делает его множество копий. Такие NAT называются тестами амплификации нуклеиновых кислот ( NAAT ). Существует несколько способов амплификации, включая полимеразную цепную реакцию (ПЦР), анализ замещения цепи (SDA) или анализ, опосредованный транскрипцией (TMA). [2]

Практически все методы амплификации нуклеиновых кислот и технологии обнаружения используют специфичность спаривания оснований Уотсона-Крика ; молекулы одноцепочечного зонда или праймера захватывают молекулы-мишени ДНК или РНК комплементарных цепей . Следовательно, конструкция цепей зонда очень важна для повышения чувствительности и специфичности обнаружения. Однако мутанты, которые составляют генетическую основу множества заболеваний человека, обычно немного отличаются от нормальных нуклеиновых кислот. Часто они различаются только одной базой, например вставками , делециями иоднонуклеотидные полиморфизмы (SNP). В этом случае легко может произойти несовершенное связывание зонда с мишенью, что приведет к ложноположительным результатам, таким как ошибочное принятие штамма, который является комменсалом, за штамм , который является патогенным. Много исследований было посвящено достижению одноосновной специфичности.

Авансы [ править ]

Нити нуклеиновой кислоты (ДНК и РНК) с соответствующими последовательностями слипаются в попарные цепочки, застегиваясь на молнии, как застежка-липучка в сушилке для одежды. Но каждый узел цепи не очень липкий, поэтому двухцепочечная цепь постоянно частично расстегивается и снова застегивается под воздействием окружающих вибраций (называемых тепловым шумом или броуновским движением). Более длинные пары более стабильны. В тестах на нуклеиновую кислоту используется «зонд», который представляет собой длинную нить с прикрепленной к ней короткой нитью. Длинная цепь праймера имеет соответствующую (комплементарную) последовательность «целевой» цепи обнаруживаемого болезнетворного организма. Болезнь нити плотно прилипает к открытой части нити длиной праймера (так называемый «точка опоры»), а затем понемногу, смещает короткий «протектор» нити от зонда.В конце концов, короткая протекторная цепь ни с чем не связана, а несвязанный короткий праймер можно обнаружить. В оставшейся части этого раздела дается некоторая история исследований, необходимых для преобразования этого процесса в полезный тест.

В 2012 году исследовательская группа Инь опубликовала статью об оптимизации специфичности гибридизации нуклеиновых кислот. [3]Они представили «зонд для замены опоры (ПК)», который состоит из предварительно гибридизированной цепи комплемента С и протекторной цепи Р. Нить комплемента длиннее, чем протекторная цепь, и на конце имеет несвязанный хвост, опору для зацепления. Комплемент идеально дополняет целевую последовательность. Когда правильная цель (X) реагирует с зондом для замены опоры (PC), P высвобождается и образуется гибридизированный продукт XC. Стандартная свободная энергия (∆) реакции близка к нулю. С другой стороны, если зонд с заменой опоры (PC) реагирует с ложной мишенью (S), реакция идет вперед, но стандартная свободная энергия увеличивается, становясь менее термодинамически выгодной. Стандартная разница свободной энергии (∆∆) достаточно значительна, чтобы обеспечить очевидную дискриминацию в урожайности. Фактор дискриминации Q рассчитывается как,выход правильной целевой гибридизации, деленный на выход ложной целевой гибридизации. В ходе экспериментов с различными зондами замены опоры для пальцев с 5 правильными мишенями и 55 ложными мишенями с энергетически репрезентативными одноосновными изменениями (замены, делеции и вставки) группа Инь пришла к выводу, что факторы дискриминации этих зондов были между 3 и 100+ со средним 26. Зонды надежно функционируют при температурах от 10 ° C до 37 ° C, от 1 мМ до 47 мМ и при концентрациях нуклеиновых кислот от 1 нМ до 5 М. Они также выяснили, что зонды с обменом на пальцах ног работают надежно даже при обнаружении РНК.делеции и вставки), группа Инь пришла к выводу, что факторы дискриминации этих зондов были между 3 и 100+ со средним значением 26. Зонды надежно функционируют при температурах от 10 ° C до 37 ° C, от 1 мМ до 47 мМ и с нуклеиновой кислотой. концентрации от 1 нМ до 5 М. Они также выяснили, что зонды обмена пальцами ног работают надежно даже при обнаружении РНК.делеции и вставки), группа Инь пришла к выводу, что факторы дискриминации этих зондов были между 3 и 100+ со средним значением 26. Зонды надежно функционируют при температурах от 10 ° C до 37 ° C, от 1 мМ до 47 мМ и с нуклеиновой кислотой. концентрации от 1 нМ до 5 М. Они также выяснили, что зонды обмена пальцами ног работают надежно даже при обнаружении РНК.

После этого были изучены дальнейшие исследования. В 2013 году группа Силига опубликовала статью о флуоресцентных молекулярных зондах, в которых также используется реакция обмена пальцами ног. [4] Это позволило оптическое обнаружение правильной цели и цели SNP. Им также удалось обнаружить SNP в образцах, полученных из E. coli.

В 2015 году группа Дэвида достигла чрезвычайно высокой (1000+) селективности однонуклеотидных вариантов (SNV), внедрив систему, называемую «конкурентные композиции». [5] В этой системе они построили модель кинетической реакции основных процессов гибридизации для прогнозирования оптимальных значений параметров, которые варьируются в зависимости от последовательностей SNV и дикого типа (WT), от конструктивной архитектуры зонда и приемника, а также от реагента. концентрации и условия анализа. Их модель преуспела в средней селективности 890 полей для 44 связанных с раком ДНК SNV, минимум 200, что представляет собой по крайней мере 30-кратное улучшение по сравнению с предыдущими анализами, основанными на гибридизации. Кроме того, они применили эту технологию для анализа низких последовательностей VAF из геномной ДНК человека после ПЦР, а также непосредственно для синтетических последовательностей РНК.

Основываясь на опыте, они разработали новый метод ПЦР под названием Blocker Displacement Amplification (BDA). [6]Это термостойкая ПЦР, которая избирательно усиливает все варианты последовательностей в пределах окна примерно 20 нт в 1000 раз по сравнению с последовательностями дикого типа, позволяя легко обнаруживать и количественно оценивать сотни вариантов потенциалов первоначально при частоте аллелей ≤ 0,1%. BDA обеспечивает аналогичную эффективность обогащения при температурах отжига от 56 ° C до 64 ° C. Такая устойчивость к температуре облегчает мультиплексное обогащение множества различных вариантов генома и, кроме того, позволяет использовать недорогие и портативные инструменты термоциклирования для обнаружения редких вариантов ДНК. BDA был подтвержден даже на типах образцов, включая клинические образцы бесклеточной ДНК, взятые из плазмы крови пациентов с раком легких.

Приложения [ править ]

  • Диагностика гонококковых и других инфекций Neisseria: амплификация конкретных последовательностей ДНК или РНК N. gonorrhea для обнаружения. [7]
  • Диагностика урогенитальной инфекции C. trachomatis [8]
  • Обнаружение Mycobacterium tuberculosis [9]
  • Обнаружение РНК или ДНК ВИЧ [10]
  • Обнаружение зоонозных коронавирусов [11]

Ссылки [ править ]

  1. ^ "Что такое тест на нуклеиновую кислоту (NAT)?" . Американский Красный Крест.
  2. ^ Питер А. Леоне, Джозеф А. Дункан (2011). Тропические инфекционные болезни: принципы, возбудители и практика (третье издание) . Филадельфия: Эльзевьер. С. 184–190.
  3. ^ Пэн Инь, Дэвид Чжан (2012). «Оптимизация специфичности гибридизации нуклеиновых кислот» . Химия природы . 4 (3): 208–214. Bibcode : 2012NatCh ... 4..208Z . DOI : 10.1038 / NCHEM.1246 . PMC 4238961 . PMID 22354435 .  
  4. ^ Георг Силиг, Шерри Чен (2013). «Условно флуоресцентные молекулярные зонды для обнаружения изменений одного основания в двухцепочечной ДНК» . Химия природы . 5 (9): 782–789. Bibcode : 2013NatCh ... 5..782C . DOI : 10.1038 / NCHEM.1713 . PMC 3844531 . PMID 23965681 .  
  5. ^ Дэвид Чжан, Цзюэсяо Шерри Ван (2015). «Дизайн ДНК-зонда на основе моделирования для последовательной сверхспецифической гибридизации» . Химия природы . 7 (7): 545–553. Bibcode : 2015NatCh ... 7..545W . DOI : 10.1038 / NCHEM.2266 . PMC 4479422 . PMID 26100802 .  
  6. ^ Дэвид Чжан, Люсия Р. Ву (2017). «Мультиплексное обогащение редких вариантов ДНК посредством селективной по последовательности и устойчивой к температуре амплификации» . Природа Биомедицинская инженерия . 1 (9): 714–723. DOI : 10.1038 / s41551-017-0126-5 . PMC 5969535 . PMID 29805844 .  
  7. ^ Питер А. Леоне, Джозеф А. Дункан (2011). Тропические инфекционные болезни: принципы, возбудители и практика (третье издание) . Филадельфия: Эльзевьер. С. 184–190.
  8. ^ Fan, Хуэйчжоу (2015). Молекулярная медицинская микробиология (второе издание) . Академическая пресса. С. 1449–1469.
  9. ^ Риддерхоф, John C (2009). Туберкулез . Эльзевир. С. 738–745.
  10. Перейти ↑ Gillespie, Susan L. (2013). Клиническая иммунология (четвертое издание) . Эльзевир. С. 465–479.
  11. ^ Шмидт, Майкл; Брикснер, Вероника; Рустер, Бриджит; Hourfar, Майкл К .; Дростен, Кристиан ; Прайзер, Вольфганг; Зейфрид, Эрхард; Рот, В. Курт (апрель 2004 г.). «NAT-скрининг доноров крови на коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома потенциально может предотвратить передачу, связанную с переливанием крови» . Переливание . 44 (4): 470–475. DOI : 10.1111 / j.1537-2995.2004.03269.x . ISSN 0041-1132 . PMID 15043560 .