Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Картофельный вирус Y
Классификация вирусов е
(без рейтинга):Вирус
Царство :Рибовирия
Королевство:Орторнавиры
Тип:Писувирикота
Учебный класс:Stelpaviricetes
Заказ:Пататавиралес
Семья:Potyviridae
Род:Потивирус
Разновидность:
Картофельный вирус Y
Синонимы

вирус бринджальной мозаики
дурман 437 вирус
картофеля вирус акропетального некроза
картофеля вирус тяжелой мозаики вирус
табачной жилки

Вирус картофеля Y (PVY) является патогенным вирусом растений семейства Potyviridae и одним из наиболее важных вирусов растений, влияющих на производство картофеля .

Заражение растений картофеля PVY приводит к появлению множества симптомов в зависимости от штамма вируса . Самым легким из этих симптомов является потеря продуктивности, но наиболее опасным является «кольцевая некротическая болезнь клубней картофеля» (PTNRD). Некротические кольцевые пятна делают картофель нерентабельным и, следовательно, могут привести к значительной потере дохода. PVY может передаваться от тлих векторов , но также может оставаться в состоянии покоя в семенном картофеле. Это означает, что использование одной и той же линии картофеля для производства семенного картофеля в течение нескольких последовательных поколений приведет к прогрессивному увеличению вирусной нагрузки и последующей потере урожая .

Рост вирусной инфекции картофеля за последние несколько лет привел к значительным потерям для картофельной промышленности Южной Африки. Повышенный уровень инфицирования можно объяснить несколькими факторами. К ним относятся заметное снижение эффективности и применения химикатов, используемых для борьбы с переносчиками, использование зараженного семенного картофеля при выращивании, неправильные методы орошения и земледелия, а также отсутствие чувствительного, быстрого и надежного метода обнаружения. [1] Повышение средней температуры зимы в результате глобального потепления также привело к увеличению численности тли, что, в свою очередь, привело к увеличению распространения вирусов. [1] [ необходима ссылка ]

Хозяева, штаммы и симптомы вируса Y картофеля [ править ]

Картофель на примере кольцевой некротической болезни

PVY принадлежит к роду Potyvirus , членом которого он является. Потивирус - самый крупный род вирусов растений и, возможно, самый разрушительный для посевов картофеля. [2] род насчитывает более 200 видов , которые приводят к значительным потерям в сельском хозяйстве арены. [3] PVY поражает многие экономически важные виды растений. К ним относятся картофель ( Solanum tuberosum ), табак ( Nicotiana tabacum ), томат ( Solanum lycopersicum ) и перец ( Capsicum spp.). [4]Уровень повреждения сельскохозяйственных культур определяется штаммом PVY, поражающим растения, вирусной нагрузкой, временем возникновения инфекции, а также толерантностью хозяина к вирусу. [5] Устойчивость хозяев к инфекции PVY во многих случаях низкая. Заражение поля картофеля PVY может в конечном итоге привести к потере урожая на 10–100%. [5]

Было показано, что PVY имеет разные изоляты в зависимости от симптомов, которые они вызывают у различных видов растений картофеля. [6] Обширная биологическая, серологическая и молекулярная вариабельность изолятов PVY делает особенно трудной классификацию изолятов как конкретных штаммов. Возникновение различных симптомов и появление некротической PVY NTN привело к поиску более надежных инструментов классификации, чем простая серологическая идентификация. Традиционно три главные штаммы PVY признаны: PVY C , PVY N и PVY O . PVY C , первоначально известный как вирус картофеля C, был первым, кто был признан и был идентифицирован в 1930-х годах. [7] PVY C вызывает гиперчувствительные реакции у многих сортов картофеля. Эти реакции включают образование мягких мозаичных узоров или точечных полос. В отличие от других штаммов PVY, некоторые штаммы PVY C не передаются тлей. [8] Предыдущие исследования Visser et al. [9] не идентифицировали ни один из местных изолятов как PVY C, но сообщалось, что он встречается в Южной Африке. [10] [11] Второй штамм PVY является PVY N . [12] Некоторые заметки о предполагаемом варианте вируса Solanum 2 (Картофельный вирус Y ). [12] Этот штамм был описан на растениях табака, растущих рядом с растениями картофеля. [13] PVY N приводит к некрозу листьев и легкому повреждению клубней или его отсутствию. Обыкновенная штамм PVY обозначается как PVY O . Заражение растения картофеля штаммом PVY O приводит к легкому повреждению клубней и не вызывает некроза листьев. [14] И PVY N, и PVY O являются передаваемыми тлями и встречаются в Южной Африке. В Европе было показано, что эти два штамма рекомбинируют с образованием PVY NTN . [15] [16] PVY NTNобладает способностью вызывать некротическую кольцевую пятнистость клубней картофеля (PTNRD). [15] Клубни, поврежденные PTNRD, становятся неликвидными, и заражение PVY NTN, таким образом, приводит к большему экономическому воздействию, чем заражение другими штаммами.

Передача вируса Y картофеля [ править ]

PVY может передаваться растениям картофеля через прививку , инокуляцию сока растений и через передачу тлей . Наиболее распространенный способ заражения PVY растительного материала в полевых условиях - через тлю, и хотя тля сама по себе может непосредственно повредить растения картофеля, именно их роль как вирусных переносчиков имеет наибольшее экономическое влияние. [17] [18] [19] В холодном климате тля зимует либо в виде бескрылых тлей, которые рождают живых детенышей (viviparae), либо в виде яиц. Такие растения-хозяева, как сорняки и другие культуры, служат рассадниками этой тли и образуют временную зону колонизации до того, как тля мигрирует на картофельные поля. [18]Считается, что в умеренном климате, например в Южной Африке, тля бесполым способом размножается на сорняках, других культурах, местных и садовых растениях. Это означает, что некоторое количество тлей присутствует круглый год. Важность эффективного и строгого мониторинга популяций тлей подчеркивается в обзоре Рэдклиффа и Рэгсдейла (2002), поскольку вирионы PVY попадают на картофельные поля почти исключительно крылатыми тлями из источника вируса за пределами этих полей. Бескрылая тля еще не была связана с распространением PVY на картофельных полях. [20]

Зеленая персиковая тля ( Myzus persicae ) оказалась наиболее эффективной в качестве вирусного переносчика, [5] [17] [21], но другие, такие как Aphis fabae , Aphis gossypii , Aphis nasturtii , Macrosiphum euphorbiae , Myzus (Nectarosiphon ) certus , Myzus (Phorodon) humuli и Rhopalosiphum insertum также сильно связаны с передачей вируса. [17] [21]Совет по сельскохозяйственным исследованиям - Институт овощей и декоративных растений (ARC-VOPI) 6 Южной Африки идентифицировал двадцать пять видов тлей, способных функционировать как переносчики PVY. [22] Также была установлена ​​эффективность некоторых из этих тлей в качестве переносчиков PVY (Ragsdale et al., 2001), и было обнаружено, что они различаются у разных видов. В Южной Африке наиболее распространенными и эффективными переносчиками PVY, встречающимися в полевых условиях , являются Aphis fabae , Aphis gossypii и Aphis nasturtii . [5]Помимо классификации по эффективности в качестве переносчиков, тлей также можно разделить на две подгруппы, а именно, колонизирующие и неколонизирующие виды. Колонизирующие тли - это тли, которые размножаются и приживаются на растениях картофеля, в частности, в то время как неколонизирующие тли не размножаются и не создают колоний на растениях картофеля. Колонизирующие тли лучше приспособлены к жизни на растениях картофеля и поэтому обычно считаются лучшими переносчиками PVY, чем неколонизирующие тли. Неколонизирующие тли в первую очередь не питаются растениями картофеля, но иногда питаются ими в поисках более подходящего хозяина. Их более низкая эффективность как вектора PVY компенсируется огромным количеством, в котором они встречаются. [19] [23]По этой причине все тли, присутствующие на картофельных полях и вокруг них, должны рассматриваться как возможные переносчики, а их численность должна тщательно контролироваться.

Передача PVY тлей происходит непостоянным, нециркулирующим образом, что предполагает менее тесное взаимодействие между вирионом и вектором, чем в случае циркулирующих вирионов. [24] Тот факт, что вирионы передаются непостоянным образом, означает, что вирусная репликация не происходит внутри вектора тли и что, если тля не питается инфицированными растениями, она теряет способность заражать растения после двух-трех кормлений. . [5] [25] Вирионы приложить к тлей стилета в считанные секунды и могут оставаться заразными в течение четырех до семнадцати часов. [26] [27] Расстояние, на которое могут передаваться вирионы, ограничено из-за короткого периода, в течение которого они остаются заразными.[23] Хотя короткая продолжительность жизни вне растений препятствует передаче вируса на большие расстояния, это не снижает эффективность передачи, обеспечиваемую быстрым проникновением вируса и инокуляцией в поле.

При попадании в растительную клетку белок оболочки вируса разбирается и высвобождает свой РНК- геном. Вирусная РНК служит мРНК , и хотя о ее трансляции известно немного, считается, что 5'-некодирующая область функционирует как усилитель трансляции. [28] Транслируемая мРНК приводит к образованию полипротеина, который превращается в зрелые белки. Затем каждый полипротеин расщепляется на десять различных белков, которые считаются многофункциональными. Эти белки вместе с белками хозяина собираются в репликационный комплекс. Этот комплекс выполняет отрицательную нитьСинтез РНК с использованием положительной цепи вирусной РНК в качестве матрицы. Как только были произведены дополнительные копии РНК, они кодируют синтез различных белков, как упоминалось ранее, а также белков оболочки. Эти белки оболочки теперь будут охватывать вновь сформированные геномы, чтобы дать начало новым вирионам . Было высказано предположение, что вложение вновь образованных вирионов инициируется взаимодействием белков оболочки с 5'-концом и что белок оболочки накапливается к 3'-концу. [29] Весь процесс репликации вируса происходит в эндоплазматическом ретикулуме.. Эти вновь синтезированные вирусные частицы впоследствии транспортируются через плазмодесмы к соседним растительным клеткам с помощью нескольких вспомогательных белков потивируса. Распространение вирусов внутри растения происходит в соответствии с соотношением источник-сток между созревающими и растущими тканями. [30] Концентрация вируса по всему растению высока, и это значительно увеличивает вероятность поглощения тлей. Заражение растений потивирусами может иметь различные симптомы. Инфекция может включать некроз жилок, мозаичные симптомы, а также деформацию листьев (Boonham et al., 2002). Зараженные растения, которые не проявляют симптомов, могут иметь зараженные навесы и давать продукты более низкого качества, чем их здоровые аналоги.

Potato - взаимодействие PVY NTN [ править ]

Поскольку PVY NTN вызывает большие потери в производстве картофеля, исследование взаимодействия картофеля и вируса Y NTN картофеля имеет важное значение. Чувствительные сорта картофеля реагируют на прививку PVY NTN развитием типичных симптомов. На инокулированных листьях через 5-7 дней после инокуляции развиваются хлоротичные и некротические кольцевые пятна. По мере распространения вируса по растению на неинокулированных листьях развиваются системные симптомы. Через 10 дней после инокуляции появляются морщины и мозаичный хлороз, что приводит к появлению пальмы (опадание листьев).

Вирусные защитные механизмы растений в первую очередь будут пытаться ограничить движение вируса. В противном случае он может попытаться вызвать гибель клеток в инфицированной ткани, тем самым предотвращая распространение вирионов. [31] Хотя точный механизм индукции заболевания потивирусами у растений неизвестен, известно, что эти вирусы вызывают значительное прекращение экспрессии генов хозяина во время репликации вируса. [32] [33] [34]

Интенсивно изучались физиологические изменения растений картофеля в ответ на инфекцию PVY NTN . Было показано, что на ранних стадиях заражения, то есть в первые 12 часов, гены, связанные с фотосинтезом, гены, участвующие в восприятии, передаче сигналов и защитной реакции, экспрессируются по-разному. [34] Через 24 часа после инокуляции количество салициловой кислоты увеличилось. [35]

Нарушение экспрессии генов нарушает нормальную клеточную функцию клеток, что может быть причиной физических симптомов, которые демонстрирует растение. Во время развития симптомов исследование взаимодействия между восприимчивым сортом картофеля и PVY NTN показало изменения в уровне цитокининов. [36] В инокулированных листьях с симптомами модификации структуры и размера хлоропластов [37 ] были обнаружены более низкие уровни хлорофилла и различная активность растворимых и ионно связанных пероксидаз [38] .

На более поздних стадиях заражения PVY NTN концентрация общего белка увеличивалась у чувствительного сорта картофеля, тогда как у толерантных и умеренно толерантных сортов картофеля таких выраженных изменений не наблюдалось. [39] Исследования экспрессии генов выявили изменения в экспрессии генов белков теплового шока, каталазы, β-1,3-глюканазы и генов, участвующих в фотосинтезе. [33]

Молекулярное описание вируса Y картофеля [ править ]

Вирионы потивируса состоят из нитевидных структур без оболочки, длина которых составляет 680-900 нм, а ширина - 11-15 нм. [40] Морфологически капсид потивируса состоит примерно из 2 000 копий белка оболочки (CP). [30]

Капсид инкапсулирует одну цепь положительной смысловой РНК, которая имеет длину порядка 10 т.п.н. и имеет нетранслируемую 5'-концевую область (5'-NTR), а также 3'-поли-A-хвост . [41] [42] Геном с положительным смыслом содержит одну расширенную открытую рамку считывания и действует непосредственно как мРНК. 144 нуклеотидный 5'-NTR особенно богат остатками аденина и имеет очень мало остатков гуанина . В отличие от обычной кэп-структуры, 5'NTR связан с белком, связанным с вирусным геномом ( VPg ), который, как говорят, действует как усилитель транскрипции. [28]

5'-лидерная последовательность имеет внутренний сайт входа в рибосому (IRES) и независимые от кепки регуляторные элементы трансляции (CIRE). [43] IRES управляет независимой от кэп трансляцией посредством механизма, аналогичного используемому эукариотами. [44] Расширенная открытая рамка считывания кодирует полипротеин 350 кДа. Этот полипротеин протеолитически процессируется вирусными протеазами (NIa, HC-Pro и P1) и подвергается ко- и посттрансляционному расщеплению с образованием нескольких многофункциональных белков. К ним относятся следующие: P1 (белок P1), HCPro (протеиназа вспомогательного компонента), P3 (белок P3), 6K1 (белок 1 6 кДа), CI (цилиндрическое включение), 6K2 (белок 2 6 кДа), VPg.(Вирусный белок, связанный с геномом), NIaPro (ядерный белок включения a, протеиназный домен), NIb (ядерный белок включения b) и CP (белок оболочки). [30]

Диагностические методы обнаружения вируса Y картофеля [ править ]

ELISA [ править ]

Раньше посевы проверяли визуально, чтобы определить, свободны ли они от болезней. Визуальный осмотр также использовался в качестве основы для сертификации семян. Определить вирусный статус посредством визуального осмотра невероятно сложно, поскольку симптомы могут быть замаскированы или инфекция скрыта. [23] В результате были введены послеродовые испытания и проверки. Эти испытания включали выращивание ранее собранного материала в теплицах. Полученные растения проверяли для более точной оценки вирусного статуса. Хотя этот метод скрининга действительно предлагал некоторую степень мониторинга вирусного присутствия, он был субъективным и крайне неэффективным. Иммуноферментный анализ (ИФА)скрининг посевов и семенного картофеля заменил визуальный осмотр в начале 1970-х годов. Использование ELISA дало рутинным диагностическим лабораториям быстрый, эффективный и чувствительный метод скрининга на широкий спектр вирусов растений картофеля.

Обнаружение патогенов с помощью ELISA основывается на взаимодействии между антигеном и специфическими антителами и стало популярным и экономичным средством рутинного обнаружения. В ELISA твердую фазу можно покрыть исследуемым образцом, содержащим антиген. [45] Эффективность связывания антигена с твердой фазой зависит от температуры, продолжительности воздействия, а также от концентрации. [45]Используемые твердые фазы включают нитроцеллюлозные мембраны, бумагу, стекло, агарозу и полистирол или поливинилхлоридные микротитровальные планшеты. Планшеты для микротитрования являются наиболее широко используемыми твердофазными планшетами, поскольку с ними легко обращаться, их можно автоматизировать и проводить анализ с использованием ридеров для микротитровальных планшетов. Недостатком этих планшетов является то, что они обладают высокой абсорбцией, и это увеличивает частоту неспецифического связывания компонентов, используемых в ELISA. Неспецифическое связывание с планшетами снижается за счет использования буферов, содержащих белки, такие как казеин, и неионные детергенты, такие как Tween 20. После нанесения покрытия избыток образца удаляется, и планшет обычно обрабатывают 1% раствором казеина. После этого твердую фазу обрабатывают антителами против интересующего антигена.После каждого этапа инкубации планшет промывают Твин 20, содержащим PBS. Эти этапы промывки предназначены для смывания любых неспецифически связанных компонентов.[46] Неспецифически связанные компоненты связаны менее прочно, чем специфически связанные. Обнаружение достигается либо путем добавления антитела, связанного с ферментом, либо путем добавления и обнаружения биотинилированного антитела. В системе, в которой используется связанное с ферментом антитело, последующее добавление соответствующего субстрата приводит к образованию цвета, пропорционального количеству антигена. [46] В качестве альтернативы планшет может быть покрыт антителом с последующей инкубацией с образцом, который должен быть обнаружен. Это, в свою очередь, может быть обнаружено, как описано выше, и затем называется ELISA с двойным сэндвичем антител (DAS). Обе эти системы, однако, имеют недостаток в том, что связывание фермента с антителом может привести к стерическим затруднениям.что, в свою очередь, может привести к потере функции антитела и / или фермента. [47] Это можно преодолеть с помощью биотин-авидинового или биотин-стрептавидинового мостика. В этом типе системы биотинсвязан с антителом. Молекула биотина не влияет на работу антител и легко обнаруживается с помощью авидина или стрептавидина, конъюгированных с подходящим ферментом. Стрептавидин имеет чрезвычайно высокое сродство к биотину, что приводит к даже более высокой степени специфичности, чем система, в которой фермент непосредственно связан с антигеном. Чтобы установить, присутствует ли антиген, добавляется субстрат, специфичный для используемого фермента. Затем фермент превращает субстрат в окрашенный продукт, и интенсивность цвета может быть коррелирована с количеством связанных антител и, следовательно, с количеством присутствующего антигена. DAS-ELISA имеет то преимущество, что он может повысить специфичность ELISA и уменьшить возникновение неспецифического связывания. Как результат,Принцип DAS-ELISA обычно используется в ELISA для обнаружения патогенов растений в соке растений без предварительной очистки патогена.

ELISA считается безопасным, недорогим и быстрым методом обнаружения вирусов растений. Его недорогой характер и относительная простота позволяют использовать его в качестве рабочей лошадки в сельскохозяйственном секторе и использовать для проверки тысяч образцов в год. К сожалению, ELISA не является полностью отказоустойчивым. Уровни вируса в клубнях картофеля, которые проверяются методом ELISA на предмет использования в качестве семенного картофеля, обычно низкие, пока клубни находятся в состоянии покоя. Обнаружение вирусов в этом картофеле с помощью ELISA затруднено, и значения поглощения могут упасть ниже установленного порогового значения. По этой причине скрининг семенных клубней проводится на прорастающих, а не на спящих клубнях. Хотя это приводит к более надежным показаниям, чем прямое тестирование клубней, это задерживает сертификацию семенного картофеля. [48]Другой недостаток иммуно-основанного метода обнаружения состоит в том, что изменения на уровне гена могут влиять на иммуногенность обнаруживаемого антигена. Что касается вирусов растений картофеля, мутации в гене CP могут вызывать конформационные изменения CP, что делает антитела, продуцируемые против ранее присутствующего вируса, менее эффективными.

ОТ-ПЦР [ править ]

Полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР)стал мощным и эффективным методом обнаружения вирусов растений картофеля в растительном материале картофеля и даже в спящем картофеле. Для анализа с помощью ОТ-ПЦР требуется всего лишь небольшой кусочек растительного материала. Учитывая протокол, описанный в этой диссертации, 0,1 г растительного материала достаточно для 14 500 отдельных реакций. Во время RT-PCR специфические последовательности целевой РНК экспоненциально амплифицируются в копии ДНК. Однако для того, чтобы это произошло, РНК вируса должна быть сначала транскрибирована в ДНК с помощью полимеразы обратной транскриптазы. Эта полимераза синтезирует цепь ДНК, используя РНК в качестве матрицы. Это приводит к комплексу ДНК / РНК. Для синтеза цепи ДНК из матрицы РНК требуется только обратный праймер, поскольку РНК представляет собой одну цепь, расположенную от 5 'до 3'. ВпоследствииНедавно синтезированная цепь ДНК используется в качестве матрицы для традиционной ПЦР.

Доступны различные типы полимераз обратной транскриптазы, соответствующие различным потребностям и условиям реакции. Обычно используемые ферменты обратной транскриптазы включают AMV RT, SuperScript III, ImProm-II, Omniscript, Sensiscript и Tth RT. В конце стадии RT полимеразный фермент активируется нагреванием. Также может быть, что полимераза обратной транскриптазы и ДНК-полимераза являются одним и тем же ферментом, и что фермент требует только стадии активации ДНК-полимеразы после стадии RT. Примером такого фермента является полимераза Tth. Этот фермент обладает как РНК-зависимой обратной транскриптазой, так и ДНК-зависимой полимеразной активностью. Однако активный центр ДНК-полимеразы покрыт специализированными олигонуклеотидами , называемыми аптаперами.. При температурах ниже оптимальной температуры реакции ДНК-зависимый полимеразный компонент Tth остается покрытым аптамерами. При этих температурах фермент Tth синтезирует только ДНК-копию матрицы РНК. Как только температура реакции повышается до 95 ° C, аптамеры удаляются, и компонент ДНК-зависимой полимеразы начинает амплифицировать целевую последовательность.

ПЦР-амплификация ДНК-мишени происходит в три этапа: денатурация , отжиг и удлинение. [46] Каждый из этих шагов происходит при определенной температуре в течение фиксированного периода времени. Денатурация обычно происходит при температуре от 90 до 95 ° C и приводит к диссоциации цепей ДНК. После этого реакционную смесь охлаждают до 40-70 ° C, чтобы грунтовкидля связывания с их соответствующими целевыми последовательностями. Этот этап известен как этап отжига и зависит от праймера. Температура, при которой праймеры отжигаются, имеет решающее значение. Слишком высокие температуры не позволят праймерам связываться с ДНК, что приведет к отсутствию или плохой амплификации. Слишком низкая температура отжига в конечном итоге приведет к неспецифическому связыванию праймеров и неспецифической амплификации. [46] Праймеры, связанные с областями, фланкирующими ДНК-мишень, обеспечивают 3'-гидроксильные группы для удлинения, катализируемого ДНК-полимеразой. Наиболее часто используемой ДНК-полимеразой является Taq , термостабильный фермент, выделенный из термофильной бактерии Thermus aquaticus.. ДНК-полимераза синтезирует новые цепи ДНК вдоль цепей матрицы, используя праймеры в качестве отправных точек. На этапе удлинения цепи амплифицируются за пределы целевой ДНК. Это означает, что каждая вновь синтезированная цепь ДНК будет иметь область, комплементарную праймеру. Количество продуцируемой ДНК экспоненциально увеличивается, поскольку три вышеупомянутых этапа повторяются циклически. В традиционной ПЦР эти шаги можно повторить от 20 до 55 раз. Однако проблема с амплификацией ПЦР заключается в том, что температура, необходимая для диссоциации цепи ДНК, также приводит к денатурации ДНК-полимеразы. Это частично преодолевается за счет биоинженерии полимераз, которые более термостабильны и имеют более длительный период полураспада.

Несмотря на то, что RT-PCR технически сложнее и дороже, чем ELISA, она позволяет обнаруживать низкие вирусные нагрузки. Считается, что ОТ-ПЦР в 102-105 раз более чувствительна, чем традиционный ELISA. [49]ОТ-ПЦР также позволяет обнаруживать несколько вирусных мишеней в одной реакции за счет использования нескольких комбинаций праймеров. Это называется мультиплексированием. Хотя мультиплексирование технически более требовательно, чем традиционная симплексная реакция, оно обеспечивает более высокую пропускную способность, поскольку один образец может быть протестирован на несколько вирусных штаммов за одну реакцию. Праймеры, используемые для мультиплексирования, выбираются таким образом, чтобы они давали ампликоны различного размера. Это позволяет проводить анализ после ОТ-ПЦР с использованием гель-электрофореза. Хотя RT-PCR экономит время, допускает мультиплексирование и более чувствителен, чем ELISA, необходимые реагенты и оборудование дороги и требуют более высокого уровня технических знаний. Кроме того, анализ конечного продукта с помощью гель-электрофореза трудоемок, относительно дороже,трудоемок и не поддается автоматизации. По этим причинам использование ОТ-ПЦР для рутинного скрининга неосуществимо и не заменило ИФА. Однако это дает отрасли возможность выявить пограничные случаи, особенно в случае сертификации семенного картофеля.

Количественная ПЦР [ править ]

В большинстве традиционных ПЦР полученные продукты анализируются после завершения ПЦР. Это называется анализом конечной точки и обычно носит качественный характер, а не количественный. Для этого вида анализа продукты в основном анализируются на агарозном геле и визуализируются с использованием бромистого этидия в качестве флуоресцентного красителя . Прямая корреляция между силой сигнала и начальной концентрацией образца невозможна при использовании анализа конечных точек, поскольку эффективность ПЦР снижается по мере приближения реакции к фазе плато. Количественная ПЦРоднако предлагает точную и быструю альтернативу традиционной ПЦР. Количественная ПЦР предлагает исследователю возможность амплифицировать и проанализировать продукт в одной пробирке с использованием флуоресцентных красителей. Это известно как гомогенная ПЦР. Во время количественной ПЦР увеличение флуоресценции коррелирует с увеличением продукта. Благодаря использованию различных специфических красителей количественная ПЦР может использоваться для различения различных штаммов вируса и даже для обнаружения точечных мутаций. Основным преимуществом количественной ПЦР является то, что не требуется анализ полученных продуктов с помощью гель-электрофореза. Это означает, что количественная ПЦР может быть реализована как высокопроизводительный метод скрининга образцов.

Количественная ПЦР была описана для обнаружения [50] и дискриминации PVY O и PVY N изолирует [51] [52] и для надежной дискриминации между PVY НТНА и PVY N изолят. [53]

Примечания и ссылки [ править ]

  1. ^ a b Coetsee, J. (2005). Virusse bedreig hele aartappelbedryf, Landbouweekblad, 61637: 44-45.
  2. Перейти ↑ Ward, CW и Shukla, DD (1991). Таксономия потивирусов: текущие проблемы и возможные решения. Intervirology, 32: 269-296.
  3. ^ Jawaid, А. Хан AJ и Дейкстра J. (2002). Вирусы растений как молекулярные патогены. Пресса пищевых продуктов, The Haworth Press Inc., Нью-Йорк
  4. Перейти ↑ McDonald, JG, Singh, RP (1996). Диапазон хоста, симптоматика и серологические изолятов вируса картофеля Y (PVY)которые разделяют свойства как с PVY N и PVY O групп деформации. Амер. Горшок. J., 73: 309-314.
  5. ^ a b c d e Уоррен, М., Крюгер, К. и Шуман, А.С. (2005). Вирус картофеля Y (PVY) и вирус скручивания листьев картофеля (PLRV): обзор литературы по картофелю в Южной Африке. Кафедра зоологии и энтомологии факультета естественных и сельскохозяйственных наук Университета Претории.
  6. Перейти ↑ Delgado-Sanchez, S. and Grogan, RG (1970). Вирус картофеля Y. CMI / AAB Описание вирусов растений. 37: CMI / AAB, Кью, Суррей, Англия, 4 стр.
  7. ^ Salaman, RN (1930). Вирусные болезни картофеля: Полоса. Природа, 126: 241.
  8. ^ Бланко-Urgoiti, Б., Tribodet, М., Leclere, С., Ponz, Ф., Перес де San Roman, К., Legorburu, FJ и Kerlan, С. (1998). Характеристика изолятов картофельного потивируса y из партий семенного картофеля. Положение изолятов NTN, Wilga и Z. Евро. J. Pl. Путь, 104: 811-819.
  9. ^ Visser, JC, Rothmann, AH и Bellstedt, DU (неопубликовано). Оценка паттернов рекомбинации в южноафриканских штаммах вируса Y картофеля (PVY). Диплом с отличием.
  10. ^ Брант, А. А. (2001). Потивирусы. В: Loebenstein G., Berger, PH, Brunt, AA и Lawson, RH (eds), Вирусы и вирусоподобные болезни картофеля и производство семенного картофеля. Kluwer Academic Publishers, Дордрехт, стр 77-86.
  11. ^ De Bokx, JA (1981). CMI / AAB Описание вирусов растений. Potato virus Y. 37: 242. Загружено из всемирной сети: www.dpvweb.net/dprv/showdpv.php?dpvno=242
  12. ^ a b Смит, К.М. и Деннис, RWG (1940)
  13. ^ Crosslin, J., Hamm, P., Шил, П. Хана, Д. Браун, К. и Бергер, П. (2005). Серологическое и молекулярное определение изолятов некроза жилок табака вируса Y картофеля (PVY N ) из картофеля, выращенного в западных Соединенных Штатах. Амер. J. Pot. Res., 82: 263-269.
  14. ^ Boonham, Н. Уолша, К., Хомс, М., Престон, С., Северный, Дж и Баркер, И. (2002). Биологическое сравнение и сравнение последовательностей изолятов вируса Y картофеля, ассоциированных с некротической кольцевой болезнью клубней картофеля. Pl. Путь, 51: 117-126.
  15. ^ a b Бунхэм, Н., Уолш, К., Престон, С., Норт, Дж., Смит, П. и Баркер, И. (2002). Обнаружение некротических изолятов вируса Y картофеля и точное различение штаммов PVY O , PVY N и PVY C с помощью ОТ-ПЦР. J. Virol. Мет., 102: 103–112.
  16. ^ Lorenzen, JH, Meacham, Т. Бергер, PH, Шил, PJ, Crosslin, JM, Hamm, ПБ и Копп, H. (2006). Полногеномная характеристика изолятов вируса Y картофеля, собранных на западе США, и их сравнение с изолятами из Европы и Канады. Arch. Virol., 151: 1055-1074.
  17. ^ a b c Халберт, С.Е., Корсини, Д.Л. и Вибе, Массачусетс (2003). Эффективность передачи вируса Y картофеля для некоторых распространенных тлей в Айдахо. Амер. J. Pot. Res., 80: 87-91.
  18. ^ a b Рэдклифф, Е.Б. и Рэгсдейл, Д.В. (2002). Вирусы картофеля, передаваемые тлями: важность понимания биологии переносчиков. Амер. J. Pot. Res. 79: 353-386.
  19. ^ а б Рэдклифф, Е.Б. (1982). Насекомые-вредители картофеля. Анна. Р. Энто., 27: 173-204.
  20. ^ Ragsdale, DW, Рэдклифф, EB, DiFonzo, CD (1994). Пороги действия для тли-переносчика вируса скручивания листьев картофеля, стр. 99-110. В: Zehnder, GW, Powelson, ML, Jansson, RK и Raman, KV [ed.], Достижения в биологии и борьбе с вредителями картофеля. Американское фитопатологическое общество, Миннесота, США.
  21. ^ а б Ван Хоф, HA (1980). Тли-переносчики вируса картофеля YN. Нет. J. Pl. Путь, 86: 159.
  22. Перейти ↑ Thompson, GJ (1997). Изучение и борьба с вирусными болезнями картофеля. В: Landbounavorsingsraad Roodeplaat: Aartappelnavorsing 1996/1997. Совет сельскохозяйственных исследований, Претория.
  23. ^ a b c Роберт Ю., Вудфорд, JAT и Ducray-Bourdin, DG (2000). Некоторые эпидемиологические подходы к борьбе с вирусными болезнями, передаваемыми тлями, на посевах семенного картофеля в Северной Европе. Вир. Res. 71: 33-47.
  24. ^ Грей, SM (1996). Белки вирусов растений, участвующие в передаче естественных векторов. Trends Microbiol. 4: 259-264.
  25. ^ Брэдли, RHE и Райдаут, DW (1953). Сравнительная передача вируса Y картофеля четырьмя видами тлей, поражающих картофель. Может. J. Zool., 31: 333-341.
  26. Перейти ↑ Harrison, BD (1984). CMI / AAB Описание вирусов растений. Вирус скручивания листьев картофеля 291 (пересмотренный № 36). www.dpvweb.net/dpv/showdpv.php?dvpno=291.
  27. ^ Костив, М. (1975). Исследование удержания вирусов картофеля M и Y у двух видов тлей (Myzus persicae Sulz. И Aphis nasturtii Kalt.). Горшок. Res., 18: 637–640.
  28. ^ a b Кэррингтон, Дж. К. и Фрид, Д. Д. (1990). Кеп-независимое усиление трансляции 5'-нетранслируемой областью потивируса растений. J. Virol., 64: 1590-1597.
  29. Перейти ↑ Wu, X and Shaw, JG (1998). Доказательства того, что сборка потивируса начинается около 5'-конца вирусной РНК. J. Gen. Virol., 79: 1525–1529.
  30. ^ a b c Talbot, Нью-Джерси (2004). Взаимодействие растений с патогенами. Блэквелл Паблишинг. CRC Press.
  31. ^ Bagnall, RH и Брэдли RHE (1958). Устойчивость картофеля к вирусу Y. Фитопатология, 48: 61-120.
  32. ^ Бушелл, М. и Сарнов, П. (2002). Взлом аппарата трансляции РНК-вирусами. J. Cell Biol., 158: 395-399.
  33. ^ a b Помпе-Новак, М., Груден, К., Бэблер, С., Кречич-Стрес, Х., Ковач, М., Йонгсма, М. и Равникар, М. (2006). Вирус Y картофеля вызывал изменения в экспрессии генов картофеля (Solanum tuberosum L.). Physio. и Мол. Pl Path., 67: 237-247.
  34. ^ a b Baebler Š, Krečič-Stres H, Rotter A, Kogovšek P, Cankar K, Kok EJ, Gruden K, Kovač M, el J, Pompe-Novak M, Ravnikar M, 2009. PVYNTN вызывает ответ разнообразной экспрессии генов в различные генотипы картофеля в первые 12 ч после инокуляции. Мол Растение Патол 10, 263-275.
  35. ^ Кречич-Стрес Х., Вучак С., Равникар М., Ковач М. 2005. СистемнаяинфекцияY NTN вируса картофеляи уровни салициловой и гентизиновой кислот в различных генотипах картофеля. Завод Патол, 54: 441-447
  36. ^ Dermastia M., Ravnikar M. 1996. Измененный цитокининовый образец и повышенная устойчивость к вирусу Y NT N картофеля у восприимчивого сорта картофеля (Solanum tuberosum L.), выращенного in vitro. Physiol Mol Plant P, 48: 65-71
  37. ^ Помпе-Новак М., Вришер М., Равникар М. 2001. Ультраструктура хлоропластов в листьях растений картофеля, инфицированных вирусом Y NTN картофеля. Фитон, 41: 215-226.
  38. ^ Милавец М., Равникар М., Ковач М. 2001. Пероксидазы и фотосинтетические пигменты в восприимчивом картофеле, инфицированном вирусом картофеля YNTN. Физиология растений Биох 39: 891-898
  39. ^ Груден К., Штрукель Б., Равникар М., Херцог-Великонья Б. 2000. Предполагаемый белок, связанный с вириальной резистентностью, выделенный из сорта картофеля Санте, устойчивого кинфекцииPVY NTN . Фитон, 40: 191-200
  40. ^ Эдвардсон, младший (1947). Некоторые свойства Y-группы вирусов картофеля. Серия монографий о сельскохозяйственных экспериментальных станциях Флориды, 4: 398.
  41. ^ Догерти, WG и Кэррингтон, JC (1988). Экспрессия и функция продуктов потивирусных генов. Анну. Преподобный Phytopathol., 26: 123-143.
  42. ^ Ван дер Влугт, Р., Аллефс, С., Де Хаан, П. и Гольдбах, Р. (1989). Нуклеотидная последовательность 3'-концевой области YN РНК вируса картофеля. J. Gen. Virol., 70: 229-233.
  43. ^ Далер, BJ, Шар, PJ, Devantier., Y. и Лалиберте, Ж.-Ф. (1994). Доказательства наличия внутреннего сайта входа в рибосомы в 5'-нетранслируемой области РНК потивируса мозаики репы. J. Gen. Virol., 75: 3157-3165.
  44. ^ Niepel, М. и Гэлли, ДР (1999). Идентификация и характеристика функциональных элементов в 5'-лидере вируса травления табака, необходимых для независимой от кэп трансляции. J. Gen. Virol., 79: 897-904.
  45. ^ а б Тейссен, П. (1985). Burdon, RHand Knippenberg, PH [ed], Лабораторные методы в биохимии и практике молекулярной биологии и теория иммуноферментных анализов, том 15, Elsevier Science Publishers BV, Амстердам.
  46. ^ a b c d Уилсон, К. и Уокер, Дж. (2000). Практическая биохимия: принципы и методы. (5-е изд). The Press Syndicate, Кембриджский университет, Кембридж, Великобритания
  47. Перейти ↑ Blake, C. and Gould, BJ (1984). Использование ферментов в иммуноферментных методах. Аналитик, 109: 533-547.
  48. ^ Gugerli, П. и Gehriger, W. (1980). Иммуноферментный анализ (ИФА) для обнаружения вируса скручивания листьев картофеля и вируса Y картофеля в клубнях картофеля после искусственного нарушения покоя. Горшок. Res., 23: 353–359.
  49. ^ Мамфорд, Р., Фишер, Т., Элмор J., Виккерс, Д., Лебедь, Х., Уолш, К., Баркер, И. и Boonham, Н. (2004). Разработка рутинного метода прямого тестирования клубней в качестве быстрой и надежной альтернативы традиционному тестированию на приращение. 12-е заседание секции вирусологии EARP Ренн, Франция, 2004 г .: выдержки из устных презентаций и стендовые доклады. Доступно: http://www.rennes.inra.fr/eapr2004/abstracts.htm
  50. ^ Agindotan, БО, Шил, PJ, Бергер, PH, 2007. Одновременное обнаружение картофельных вирусов, PLRV, ПВА, PVX и PVY из покоящихся клубней картофеляпомощью TaqMan (R) в режиме реального времени ОТ-ПЦР. J Virol методы 142, 1-9.
  51. ^ Балм-Синибальди, В., Tribodet, М., Croizat, Ф., Lefeuvre П., Kerlan, К., Жако, Е., 2006. Улучшение вирус картофеля Y (PVY) обнаружение и количественноепомощью PVYN- и PVYO-специфические анализы ОТ-ПЦР в реальном времени. J. Virol Methods 134, 261-266.
  52. ^ Jacquot, E., Tribodet, M., Croizat, F., Balme-Sinibaldi, V., Kerlan, C., 2005. Метод, основанный на однонуклеотидном полиморфизме, для специфической характеристикиизолятовY O и Y N вируса картофеля. Y (PVY). Дж. Вирол Методы 125, 83-93.
  53. ^ Kogovšek, П. Гоу, Л., Помпа-Новак, М., Груден, К., Фостер,Д., Boonham, Н., Ravnikar, М., 2008. Пошаговый RT ПЦРреальном времени для чувствительного обнаружения и дискриминация изолятов вируса Y картофеля. Дж. Вирол Методы 149, 1-11.

Внешние ссылки [ править ]

  • ICTVdB - Универсальная база данных вирусов: вирус картофеля Y
  • Семейные группы - метод Балтимора
  • Стелленбосский университет - кафедра биохимии