Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Белки внешней мембраны митохондрий идентифицируются с помощью метки близости.

Близкое мечение ( PL ), катализируемое ферментами , также известное как мечение на основе близости , представляет собой лабораторный метод, который маркирует биомолекулы , обычно белки или РНК , проксимальные к интересующему белку. [1] Создав слияние генов в живой клетке между представляющим интерес белком и сконструированным меченным ферментом, биомолекулы, пространственно проксимальные к интересующему белку, затем могут быть выборочно помечены биотином для раскрытия и анализа. Маркировка близости использовалась для идентификации компонентов новых клеточных структур и для определенияпартнеры белок-белкового взаимодействия , среди прочего. [2]

История [ править ]

До разработки метки близости определение близости белка в клетках основывалось на изучении белок-белковых взаимодействий с помощью таких методов, как аффинная очистка-масс-спектрометрия и анализ лигирования на основе близости . [3]

DamID - это метод, разработанный в 2000 году Стивеном Хеникоффом для идентификации частей генома, проксимальных к интересующему белку хроматина. DamID основан на слиянии ДНК-метилтрансферазы с белком хроматина для неестественного метилирования ДНК, которая затем может быть секвенирована для выявления участков метилирования генома рядом с белком. [4] Исследователи руководствовались стратегией слияния белков DamID для создания метода сайт-специфической маркировки белков-мишеней, кульминацией чего стало создание BioID на основе биотиновых белков в 2012 году. [1] Алиса Тинг и лаборатория Тинга. в Стэнфордском университетеразработали несколько белков, которые демонстрируют повышение эффективности и скорости бесконтактного мечения на основе биотина. [5] [6] [7] [8]

Принципы [ править ]

Маркировка близости основана на маркировке фермента, который может беспорядочно биотинилировать близлежащие биомолекулы. Мечение биотина может быть достигнуто с помощью нескольких различных методов, в зависимости от вида фермента-метки.

  • BioID, также известный как BirA *, представляет собой мутантную биотинлигазу E. coli, которая катализирует активацию биотина АТФ. Активированный биотин недолговечен и поэтому может диффундировать только к области, проксимальной к BioID. Маркировка достигается, когда активированный биотин реагирует с соседними аминами , такими как амины боковой цепи лизина, обнаруженные в белках. [1] TurboID - это биотинлигаза, созданная путем эволюции, направленной на отображение поверхности дрожжей . TurboID обеспечивает время маркировки ~ 10 минут вместо ~ 18 часов, требуемых BioID. [5]
  • APEX представляет собой производное аскорбатпероксидазы, которое зависит от перекиси водорода для катализирования окисления биотин-тирамида, также известного как биотин-фенол, до короткоживущих и реактивных свободных радикалов биотин-фенол . Мечение достигается, когда этот промежуточный продукт реагирует с различными функциональными группами близлежащих биомолекул. APEX также можно использовать для местного осаждения диаминобензидина, предшественника красителя для электронной микроскопии . APEX2 является производным от APEX, созданным путем эволюции, направленной на поверхностный дисплей дрожжей. APEX2 показывает улучшенную эффективность мечения и уровни клеточной экспрессии. [8]

Чтобы пометить белки, расположенные рядом с интересующим белком, типичный эксперимент с близким мечением начинается с клеточной экспрессии слитого APEX2 с интересующим белком, который локализуется в нативной среде интересующего белка. Затем клетки инкубируют с биотин-фенолом, затем кратковременно с перекисью водорода, инициируя образование свободных радикалов биотин-фенола и мечение. Чтобы свести к минимуму повреждение клеток, реакцию гасят с помощью антиоксидантного буфера. Клетки лизируются, и меченые белки удаляются с помощью стрептавидиновых гранул. Белки перевариваются трипсином , и, наконец, полученные пептидные фрагменты анализируются с использованием методов протеомики дробовика, таких как LC-MS / MS или SPS-MS 3 .[8]

Если вместо этого слияние белков генетически недоступно (например, в образцах тканей человека), но известно антитело к представляющему интерес белку, бесконтактное мечение все еще может быть включено путем слияния фермента-метки с антителом, а затем инкубации слияния с образцом . [9] [10]

Приложения [ править ]

Методы метки близости были использованы для изучения протеомов биологических структур, которые иначе трудно изолировать чисто и полностью, таких как реснички , [11] митохондрии , [6] постсинаптические щели , [2] р-тельца , стрессовые гранулы , [12] ] и липидные капли . [13]

Слияние APEX2 с рецепторами, связанными с G-белками (GPCR), позволяет отслеживать передачу сигналов GPCR с временным разрешением 20 секунд [14], а также идентифицировать неизвестные GPCR-связанные белки. [15]

Маркировка близости также использовалась для транскриптомики и интерактомики . В 2019 году Алиса Тинг и лаборатория Тинга использовали APEX для идентификации РНК, локализованной в определенных клеточных компартментах. [16] [17] В 2019 году BioID был привязан к транскрипту мРНК бета-актина для изучения динамики его локализации. [18] Близость маркировка также используется , чтобы найти партнер взаимодействия гетеродимерного протеинфосфатаза , из miRISC (микроРНК-индуцированного глушители комплекса) белок Ago2 , и рибонуклеопротеинов . [3]

Последние события [ править ]

Маркировка близости на основе TurboID использовалась для идентификации регуляторов рецептора, участвующего в врожденном иммунном ответе , NOD-подобного рецептора . [19] BioID на основе маркировки близости была использована для определения молекулярного состава рака молочной железы клеток invadopodia , которые являются важными для метастазирования. [20] Исследования близкого мечения на основе биотина демонстрируют повышенное мечение белков внутренне неупорядоченных областей , предполагая, что близкое мечение на основе биотина может быть использовано для изучения роли IDR. [21] фотосенсибилизатораНацеленная на ядро ​​малая молекула также была разработана для фотоактивируемого бесконтактного мечения. [22]

Ссылки [ править ]

  1. ^ a b c Ру, Кайл Дж .; Ким, Дэ Ин; Райда, Манфред; Берк, Брайан (19 марта 2012 г.). «Беспорядочный гибридный белок с биотин-лигазой идентифицирует проксимальные и взаимодействующие белки в клетках млекопитающих» . Журнал клеточной биологии . 196 (6): 801–810. DOI : 10,1083 / jcb.201112098 . ISSN  0021-9525 . PMC  3308701 . PMID  22412018 .
  2. ^ а б Хань, Шо; Ли, Цзефу; Тинг, Алиса Y (2018-06-01). «Маркировка близости: протеомное картирование с пространственным разрешением для нейробиологии» . Текущее мнение в нейробиологии . Нейротехнологии. 50 : 17–23. DOI : 10.1016 / j.conb.2017.10.015 . ISSN 0959-4388 . PMC 6726430 . PMID 29125959 .   
  3. ^ a b Тринкл-Малкахи, Лаура (31.01.2019). «Последние достижения в методах маркировки на основе близости для картирования интерактомов» . F1000 Исследования . 8 : 135. DOI : 10,12688 / f1000research.16903.1 . ISSN 2046-1402 . PMC 6357996 . PMID 30774936 .   
  4. ^ Steensel, Bas van; Хеникофф, Стивен (апрель 2000 г.). «Идентификация in vivo ДНК-мишеней белков хроматина с использованием привязанной метилтрансферазы Dam» . Природа Биотехнологии . 18 (4): 424–428. DOI : 10.1038 / 74487 . ISSN 1546-1696 . 
  5. ^ a b Бранон, Тесс С .; Bosch, Justin A .; Санчес, Ариана Д .; Udeshi, Namrata D .; Свинкина, Таня; Карр, Стивен А .; Фельдман, Джессика Л .; Перримон, Норберт; Тинг, Алиса Ю. (2018-10-01). «Эффективное бесконтактное маркирование живых клеток и организмов с помощью TurboID» . Природа Биотехнологии . 36 (9): 880–887. DOI : 10.1038 / nbt.4201 . ISSN 1546-1696 . PMC 6126969 . PMID 30125270 .   
  6. ^ a b Ри, Хён Ву; Цзоу, Пэн; Udeshi, Namrata D .; Мартелл, Джеффри Д .; Mootha, Vamsi K .; Карр, Стивен А .; Тинг, Алиса Ю. (2013-03-15). «Протеомное картирование митохондрий в живых клетках с помощью пространственно ограниченного ферментативного мечения» . Наука . 339 (6125): 1328–1331. Bibcode : 2013Sci ... 339.1328R . DOI : 10.1126 / science.1230593 . ISSN 0036-8075 . PMC 3916822 . PMID 23371551 .   
  7. ^ Лам, Стефани S .; Мартелл, Джеффри Д .; Kamer, Kimberli J .; Deerinck, Thomas J .; Эллисман, Марк Х .; Mootha, Vamsi K .; Тинг, Алиса Ю. (январь 2015 г.). «Направленная эволюция APEX2 для электронной микроскопии и бесконтактной маркировки» . Методы природы . 12 (1): 51–54. DOI : 10.1038 / nmeth.3179 . ЛВП : 1721,1 / 110613 . ISSN 1548-7105 . 
  8. ^ a b c Калочей, Мэриан (2019). «APEX-катализируемое пероксидазой метки близости и мультиплексная количественная протеомика». В Сунбуле, Мурат; Яшке, Андрес (ред.). Маркировка близости . Маркировка близости: методы и протоколы . Методы молекулярной биологии. 2008 . Springer. С. 41–55. DOI : 10.1007 / 978-1-4939-9537-0_4 . ISBN 978-1-4939-9537-0. PMID  31124087 .
  9. ^ Рис, Джоанна S .; Ли, Сюэ-Вэнь; Перретт, Сара; Лилли, Кэтрин С .; Джексон, Энтони П. (2015-11-01). «Белковые соседи и близость протеомики» . Молекулярная и клеточная протеомика . 14 (11): 2848–2856. DOI : 10.1074 / mcp.R115.052902 . ISSN 1535-9476 . PMC 4638030 . PMID 26355100 .   
  10. ^ Бар, Дэниел З; Аткатш, Кэтлин; Таварес, Уррака; Эрдош, Майкл Р.; Грюнбаум, Йосеф; Коллинз, Фрэнсис С. (февраль 2018 г.). «Биотинилирование путем распознавания антител - метод бесконтактного мечения» . Методы природы . 15 (2): 127–133. DOI : 10.1038 / nmeth.4533 . ISSN 1548-7091 . PMC 5790613 . PMID 29256494 .   
  11. ^ Мик, Дэвид У .; Родригес, Рэйчел Б.; Лейб, Райан Д .; Адамс, Кристофер М .; Chien, Allis S .; Gygi, Стивен П .; Начуры, Максенс В. (2015-11-23). «Протеомика первичных ресничек по метке близости» . Клетка развития . 35 (4): 497–512. DOI : 10.1016 / j.devcel.2015.10.015 . ISSN 1878-1551 . PMC 4662609 . PMID 26585297 .   
  12. ↑ Юн, Джи-Ён; Dunham, Wade H .; Хонг, Со Чжон; Рыцарь, Джеймс Д.Р.; Башкуров Михаил; Чен, Джинни И .; Багчи, Халил; Ратод, Бхавиша; Маклауд, Грэм; Eng, Саймон WM; Анже, Стефан (февраль 2018 г.). «Картирование близости с высокой плотностью выявляет субклеточную организацию гранул и тел, связанных с мРНК» . Молекулярная клетка . 69 (3): 517–532.e11. DOI : 10.1016 / j.molcel.2017.12.020 . ISSN 1097-2765 . PMID 29395067 .  
  13. ^ Берсукер, Кирилл; Петерсон, Кларк WH; К, Милтон; Sahl, Steffen J .; Савихин Виктория; Гроссман, Элизабет А .; Nomura, Daniel K .; Ольцманн, Джеймс А. (2018-01-08). «Стратегия метки близости обеспечивает понимание состава и динамики протеомов липидных капель» . Клетка развития . 44 (1): 97–112.e7. DOI : 10.1016 / j.devcel.2017.11.020 . ISSN 1534-5807 . PMID 29275994 .  
  14. ^ Пэк, Джэхо; Калочай, Мэриан; Staus, Dean P .; Винглер, Лаура; Пасколутти, Роберта; Пауло, Жоао А .; Gygi, Стивен П .; Круз, Эндрю К. (04 06, 2017). «Многомерное отслеживание передачи сигналов GPCR с помощью метки близости, катализируемой пероксидазой» . Cell . 169 (2): 338–349.e11. DOI : 10.1016 / j.cell.2017.03.028 . ISSN 1097-4172 . PMC 5514552 . PMID 28388415 .    Проверить значения даты в: |date=( помощь )
  15. ^ Lobingier, Braden T .; Хюттенхайн, Рут; Эйхель, Келси; Миллер, Кеннет Б.; Тинг, Алиса Ю.; фон Застров, Марк; Кроган, Неван Дж. (04 06, 2017). «Подход к пространственно-временному разрешению сетей взаимодействия белков в живых клетках» . Cell . 169 (2): 350–360.e12. DOI : 10.1016 / j.cell.2017.03.022 . ISSN 1097-4172 . PMC 5616215 . PMID 28388416 .    Проверить значения даты в: |date=( помощь )
  16. ^ Шилдс, Эмили Дж .; Петраковичи, Ана Ф .; Бонасио, Роберто (2019-04-15). «Чрезвычайно универсальный: биохимические и биологические функции длинных некодирующих РНК» . Биохимический журнал . 476 (7): 1083–1104. DOI : 10.1042 / BCJ20180440 . ISSN 0264-6021 . PMC 6745715 . PMID 30971458 .   
  17. ^ Fazal, Furqan M .; Хан, Шо; Паркер, Кевин Р .; Kaewsapsak, Pornchai; Сюй, Цзинь; Boettiger, Alistair N .; Chang, Howard Y .; Тинг, Алиса Ю. (11.07.2019). "Атлас субклеточной локализации РНК, выявленный APEX-Seq" . Cell . 178 (2): 473–490.e26. DOI : 10.1016 / j.cell.2019.05.027 . ISSN 0092-8674 . PMID 31230715 .  
  18. ^ Мукерджи, Джойита; Гермеш, Орит; Элискович, Каролина; Налпас, Николас; Франц-Вахтель, Мирита; Мачек, Борис; Янсен, Ральф-Петер (25.06.2019). «Картирование взаимодействия мРНК β-актина путем биотинилирования близости» . Труды Национальной академии наук . 116 (26): 12863–12872. DOI : 10.1073 / pnas.1820737116 . ISSN 0027-8424 . PMID 31189591 .  
  19. ^ Чжан, Юнлян; Сун, Гаоюань; Lal, Neeraj K .; Нагалакшми, Уграппа; Ли, Юаньюань; Чжэн, Вэньцзе; Хуанг, Пинь-цзюй; Бранон, Тесс С .; Тинг, Алиса Ю.; Уолли, Джастин У .; Динеш-Кумар, Савитрамма П. (19.07.2019). «Близкое маркирование на основе TurboID показывает, что UBR7 является регулятором иммунитета, опосредованного иммунным рецептором N NLR» . Nature Communications . 10 (1): 1–17. DOI : 10.1038 / s41467-019-11202-Z . ISSN 2041-1723 . 
  20. ^ Туо, Сильви; Мамелонет, Клэр; Саламе, Джоэль; Остаколо, Кевин; Чанез, Брайс; Салаун, Даниэль; Бодле, Эмили; Одебер, Стефан; Камоин, Люк; Бадаче, Али (22.04.2020). «Протеомный подход с меткой близости для исследования молекулярного ландшафта инвадоподий в клетках рака молочной железы» . Научные отчеты . 10 (1): 1–14. DOI : 10.1038 / s41598-020-63926-4 . ISSN 2045-2322 . 
  21. ^ Минде, Дэвид-Пол; Рамакришна, Манаса; Лилли, Кэтрин С. (22 января 2020 г.). «Биотиновая бесконтактная метка благоприятствует развернутым белкам и позволяет изучать внутренне неупорядоченные области» . Биология коммуникации . 3 (1): 1–13. DOI : 10.1038 / s42003-020-0758-у . ISSN 2399-3642 . 
  22. ↑ Тамура, Томонори; Такато, Микико; Шионо, Кейя; Хамачи, Итару (05.12.2019). «Разработка фотоактивируемого метода метки близости для идентификации ядерных белков» . Письма по химии . 49 (2): 145–148. DOI : 10,1246 / cl.190804 . ISSN 0366-7022 .