Анализ близости лигирования
Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Рисунок 1 : PLA начинается со связывания антител разных видов с 2 представляющими интерес белками, в данном случае белком * (звездочка) и белком #

Анализ методом проксимального лигирования ( in situ PLA ) - это технология, которая расширяет возможности традиционных иммуноанализов, включая прямое обнаружение белков , белковых взаимодействий и посттрансляционных модификаций с высокой специфичностью и чувствительностью. [1] Белковые мишени могут быть легко обнаружены и локализованы с разрешением отдельных молекул и объективно количественно определены в немодифицированных клетках и тканях. Используя только несколько клеток, субклеточные события, даже временные или слабые взаимодействия, выявляются in situ, и субпопуляции клеток могут быть дифференцированы. В течение нескольких часов результат обычной коиммунопреципитациии методы совместной локализации могут быть подтверждены. [2]

Принцип PLA

Рисунок 2 : Связывание зондов PLA.

Два первичных антитела, продуцируемые у разных видов, распознают антиген- мишень на интересующих белках (рис. 1). Вторичные антитела (2 O Ab) , направленные против константных областей различных первичных антител, называемых PLA зондов, связываются с первичными антителами (рисунок 2).

Рисунок 3 : Начинается синтез ДНК по катящемуся кругу.

Каждый из зондов PLA имеет прикрепленную к короткой последовательности специфичную цепь ДНК . Если зонды PLA находятся в непосредственной близости (то есть, если два исходных интересующих белка находятся поблизости или являются частью белкового комплекса, как показано на рисунках), нити ДНК могут участвовать в синтезе ДНК по катящемуся кругу при добавлении двух другие последовательности-специфичные олигонуклеотиды ДНК вместе с соответствующими субстратами и ферментами (рис. 3).

Рисунок 4 : Флуоресцентные зонды связываются с амплифицированной ДНК.

Реакция синтеза ДНК приводит к многократному усилению круга ДНК. Затем добавляются комплементарные олигонуклеотидные зонды с флуоресцентной меткой, и они связываются с амплифицированной ДНК (рис. 4). Результирующая высокая концентрация флуоресценции легко видна как отчетливое яркое пятно при просмотре с помощью флуоресцентного микроскопа . [3] В показанном конкретном случае (рис. 5) ядро увеличено, потому что это клетка В-клеточной лимфомы . Два представляющих интерес белка - это В-клеточный рецептор и MYD88 . Обнаружение взаимодействия в цитоплазме было интересным, поскольку считается, что рецепторы В-клеток расположены в клеточной мембране.[4]

Рисунок 5 : Изображение флуоресцентной микроскопии, показывающее взаимодействие белков в цитоплазме. Ядро выделено синим цветом, продукт PLA - красным.

Приложения

PLA, как описано выше, использовался для изучения аспектов развития животных [5] [6] и рака груди [7] [8] среди многих других тем. Вариант метода (rISH-PLA) был использован для изучения ассоциации белка и РНК . [9] Другой вариант in situ PLA включает в себя мультиплексный анализ PLA, который позволяет визуализировать несколько белковых комплексов параллельно. [10] PLA также можно комбинировать с другими формами считывания, такими как ELISA , [11] проточная цитометрия . [12] [13] и Вестерн-блоттинг [14]

использованная литература

  1. ^ Галлберг М, Gústafsdóttir С.М., Schallmeiner Е, Jarvius Дж, Bjarnegård М, Betsholtz С, Landegren U, Фредрикссон S (июнь 2004 г.). «Обнаружение цитокинов с помощью бесконтактного лигирования на основе антител» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 101 (22): 8420–4. Bibcode : 2004PNAS..101.8420G . DOI : 10.1073 / pnas.0400552101 . PMC  420409 . PMID  15155907 .
  2. ^ Söderberg O, Гуллберг M, Jarvius M, Риддерстрале K, Leuchowius KJ, Jarvius J, K Wester, Hydbring P, Бахрам F, Ларссон LG, Landegren U (декабрь 2006). «Прямое наблюдение индивидуальных эндогенных белковых комплексов in situ путем лигирования близости». Природные методы . 3 (12): 995–1000. DOI : 10.1038 / nmeth947 . PMID 17072308 . S2CID 21819907 .  
  3. ^ Gustafsdottir SM, Schallmeiner E, Fredriksson S, Gullberg M, Söderberg O, Jarvius M, Jarvius J, Howell M, Landegren U (октябрь 2005 г.). «Анализы лигирования с близостью для чувствительных и специфических анализов белков». Аналитическая биохимия . 345 (1): 2–9. DOI : 10.1016 / j.ab.2005.01.018 . PMID 15950911 . 
  4. ^ Staudt, Луи. «Терапия лимфомы, основанная на функциональной и структурной геномике» . videocast.nih.gov . Национальные институты здоровья . Проверено 3 февраля +2017 .
  5. ↑ Wang S, Yoo S, Kim HY, Wang M, Zheng C, Parkhouse W, Krieger C, Harden N (январь 2015 г.). «Обнаружение in situ белок-белковых комплексов в нервно-мышечном соединении личинок дрозофилы с использованием анализа близости лигирования» . Журнал визуализированных экспериментов (95): 52139. DOI : 10,3791 / 52139 . PMC 4354543 . PMID 25650626 .  
  6. Перейти ↑ Kwon J, Jeong SM, Choi I, Kim NH (2016). «ADAM10 участвует в сборке клеточных соединений в раннем развитии эмбрионов свиней» . PLOS ONE . 11 (4): e0152921. Bibcode : 2016PLoSO..1152921K . DOI : 10.1371 / journal.pone.0152921 . PMC 4820119 . PMID 27043020 .  
  7. ^ Karamouzis М.В., Dalagiorgou G, Georgopoulou U, Нонни A, M Kontos, Papavassiliou AG (февраль 2016). «Нацеливание на HER-3 изменяет характер димеризации членов семейства белков ErbB в карциномах молочной железы» . Oncotarget . 7 (5): 5576–97. DOI : 10.18632 / oncotarget.6762 . PMC 4868707 . PMID 26716646 .  
  8. ^ Vincent A, E Berthel, Dacheux E, Magnard C, Venezia NL (апрель 2016). «BRCA1 влияет на передачу сигналов протеинфосфатазы 6 посредством взаимодействия с ANKRD28». Биохимический журнал . 473 (7): 949–60. DOI : 10.1042 / BJ20150797 . PMID 27026398 . 
  9. ^ Roussis IM, Guille M, Myers FA, Scarlett GP (2016). «Анализ близости лигирования гибридизации in situ целиком РНК (rISH-PLA), анализ для обнаружения комплексов РНК-белок в интактных клетках» . PLOS ONE . 11 (1): e0147967. Bibcode : 2016PLoSO..1147967R . DOI : 10.1371 / journal.pone.0147967 . PMC 4732756 . PMID 26824753 .  
  10. ^ Leuchowius KJ, Clausson CM, Grannas K, Erbilgin Y, Botling J, Zieba A и др. (Июнь 2013). «Параллельная визуализация множественных белковых комплексов в отдельных клетках опухолевой ткани» . Молекулярная и клеточная протеомика . 12 (6): 1563–71. DOI : 10.1074 / mcp.O112.023374 . PMC 3675814 . PMID 23436906 .  
  11. ^ Эбай Т., Соуза де Оливейра FM, Лёф Л., Вик Л., Швайгер С., Ларссон А. и др. (Сентябрь 2017 г.). «Аналитически чувствительное обнаружение белка в микротитровальных планшетах с помощью лигирования близости с амплификацией с вращающимся кругом» . Клиническая химия . 63 (9): 1497–1505. DOI : 10,1373 / clinchem.2017.271833 . PMID 28667186 . 
  12. ^ Leuchowius KJ, Weibrecht I, Landegren U, L Гедда, Söderberg O (октябрь 2009). "Проточный цитометрический анализ in situ лигирования близости белков взаимодействий и посттрансляционных модификаций семейства рецепторов эпидермального фактора роста" . Цитометрия. Часть A . 75 (10): 833–9. DOI : 10.1002 / cyto.a.20771 . PMID 19650109 . S2CID 2550136 .  
  13. ^ Löf L, Arngården L, Olsson-Strömberg U, Siart B, Jansson M, Dahlin JS и др. (Апрель 2017 г.). «Проточное цитометрическое измерение клеток крови с белком слияния BCR-ABL1 при хроническом миелоидном лейкозе» . Научные отчеты . 7 (1): 623. Bibcode : 2017NatSR ... 7..623L . DOI : 10.1038 / s41598-017-00755-у . PMC 5429594 . PMID 28377570 .  
  14. ^ Лю Ю., Гу Дж, Хагнер-МакВиртер Å, Сатиянараянан П., Гуллберг М., Содерберг О. и др. (Ноябрь 2011 г.). «Вестерн-блоттинг с помощью бесконтактного лигирования для высокоэффективного анализа белков» . Молекулярная и клеточная протеомика . 10 (11): O111.011031. DOI : 10.1074 / mcp.O111.011031 . PMC 3226413 . PMID 21813417 .  
Источник « https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Proximity_ligation_assay&oldid=1033466777 »
Contribute a better translation