Система рестрикционной модификации ( система RM ) обнаружена у бактерий и других прокариотических организмов и обеспечивает защиту от чужеродной ДНК , такой как ДНК бактериофагов .
У бактерий есть ферменты рестрикции , также называемые эндонуклеазами рестрикции , которые расщепляют двухцепочечную ДНК в определенных точках на фрагменты, которые затем разрушаются другими эндонуклеазами. Это предотвращает заражение, эффективно разрушая чужеродную ДНК, введенную инфекционным агентом (например, бактериофагом ). Примерно четверть известных бактерий обладают системами RM, а из них около половины имеют более одного типа систем.
Поскольку последовательности, распознаваемые рестрикционными ферментами, очень короткие, сама бактерия почти наверняка будет содержать некоторые из них в своем геноме. Чтобы предотвратить разрушение собственной ДНК рестрикционными ферментами, добавляются метильные группы. Эти модификации не должны мешать спариванию оснований ДНК, и, следовательно, обычно только несколько конкретных оснований модифицируются на каждой цепи.
Эндонуклеазы расщепляют внутренние / неконцевые фосфодиэфирные связи. Они делают это только после распознавания определенных последовательностей в ДНК, которые обычно имеют длину 4-6 пар оснований и часто имеют палиндромную форму .
История
Система RM была впервые открыта Сальваторе Луриа и Мэри Хьюман в 1952 и 1953 годах. [1] [2] Они обнаружили, что бактериофаг, растущий внутри инфицированной бактерии, может быть изменен, так что при их высвобождении и повторном заражении родственной бактерией рост бактериофага ограничен (подавлен) (также описан Луриа в его автобиографии на страницах 45 и 99 в 1984 году). [3] В 1953 году Жан Вейгл и Джузеппе Бертани сообщили о подобных примерах модификации, контролируемой хозяином, с использованием другой системы бактериофагов. [4] Более поздняя работа Дейзи Рулланд-Дюссуа и Вернера Арбера в 1962 г. [5] и многих других последующих исследователей привела к пониманию того, что ограничение было вызвано атакой и разрушением ДНК модифицированного бактериофага специфическими ферментами бактерий-реципиентов. Дальнейшая работа Гамильтона О. Смита выделила Hin DII , первый из класса ферментов, ныне известных как рестрикционные ферменты , а Дэниел Натанс показал, что его можно использовать для рестрикционного картирования . [6] Когда эти ферменты были выделены в лаборатории, их можно было использовать для контролируемых манипуляций с ДНК, что обеспечило основу для развития генной инженерии . Вернер Арбер, Дэниел Натанс и Гамильтон Смит были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине в 1978 году за свою работу по рестрикционной модификации.
Типы
Существует четыре категории систем рестрикционной модификации: тип I, тип II, тип III и тип IV, все с активностью рестрикционного фермента и активностью метилазы (за исключением типа IV, который не имеет активности метилазы). Они были названы в порядке открытия, хотя система типа II является наиболее распространенной.
Системы типа I являются наиболее сложными и состоят из трех полипептидов: R (рестрикция), M (модификация) и S (специфичность). Полученный комплекс может как расщеплять, так и метилировать ДНК. Обе реакции требуют АТФ, и расщепление часто происходит на значительном расстоянии от сайта узнавания. Субъединица S определяет специфичность как рестрикции, так и метилирования. Расщепление происходит на различных расстояниях от последовательности распознавания, поэтому отдельные полосы нелегко визуализировать с помощью гель-электрофореза .
Системы типа II являются самыми простыми и распространенными. Вместо того, чтобы работать как комплекс, метилтрансфераза и эндонуклеаза кодируются как два отдельных белка и действуют независимо (нет белка специфичности). Оба белка распознают один и тот же сайт узнавания и поэтому конкурируют за активность. Метилтрансфераза действует как мономер , метилируя дуплекс по одной цепи за раз. Эндонуклеаза действует как гомодимер , что облегчает расщепление обеих цепей. Расщепление происходит в определенном положении, близком к последовательности узнавания или внутри нее, таким образом образуя дискретные фрагменты во время гель-электрофореза. По этой причине системы типа II используются в лабораториях для анализа ДНК и клонирования генов .
Системы типа III содержат белки R (res) и M (mod), которые образуют комплекс модификации и расщепления. Однако белок М может метилировать сам по себе. Метилирование также происходит только на одной цепи ДНК, в отличие от большинства других известных механизмов. Гетеродимер , образованный белками конкурирует R и М с самим собой путем модификации и ограничение той же самой реакции. Это приводит к неполному пищеварению. [7] [8]
Системы типа IV не являются настоящими системами RM, потому что они содержат только рестрикционный фермент, а не метилазу. В отличие от других типов ферменты рестрикции IV типа распознают и разрезают только модифицированную ДНК. [9]
Функция
Neisseria meningitidis имеет несколько систем эндонуклеаз рестрикции типа II, которые используются в естественной генетической трансформации . Естественная генетическая трансформация - это процесс, с помощью которого бактериальная клетка-реципиент может взять ДНК из соседней бактериальной клетки-донора и интегрировать эту ДНК в свой геном путем рекомбинации. Хотя ранние работы по системам рестрикционной модификации были сосредоточены на том, что бактерии защищают себя от вторжения ДНК бактериофага или другой чужеродной ДНК, теперь известно, что эти системы также могут быть использованы для ограничения ДНК, введенной естественной трансформацией из других их членов. или родственные виды.
В патогенной бактерии Neisseria meningitidis (менингококки) способность к трансформации представляет собой высокоразвитый и сложный процесс, при котором множество белков на бактериальной поверхности, в мембранах и цитоплазме взаимодействуют с поступающей трансформирующей ДНК. Системы рестрикции-модификации широко распространены в роде Neisseria . N. meningitidis имеет несколько систем эндонуклеаз рестрикции типа II. [10] Системы рестрикционных модификаций у N. meningitidis различаются по специфичности между разными кладами. [10] [11] Эта специфичность обеспечивает эффективный барьер против обмена ДНК между кладами. [10] Лурия на странице 99 своей автобиографии [3] назвал такое ограничивающее поведение «крайним проявлением недружелюбия». Ограничение-модификация, по-видимому, является основным фактором сексуальной изоляции и видообразования менингококков. [12] Caugant и Maiden [13] предположили, что системы рестрикции-модификации менингококков могут действовать, позволяя генетический обмен между очень близкими родственниками, уменьшая (но не полностью предотвращая) генетический обмен между менингококками, принадлежащими к разным клональным комплексам и родственным видам.
Системы RM также могут действовать как эгоистичные генетические элементы , вынуждая их поддерживать клетку посредством постсегрегационного уничтожения клеток. [14]
Некоторые вирусы разработали способы подрыва системы рестрикционной модификации, обычно путем модификации своей собственной ДНК, путем добавления к ней метильных или гликозильных групп, тем самым блокируя рестрикционные ферменты. Другие вирусы, такие как бактериофаги Т3 и Т7, кодируют белки, которые ингибируют рестрикционные ферменты.
Чтобы противодействовать этим вирусам, некоторые бактерии разработали рестрикционные системы, которые распознают и расщепляют только модифицированную ДНК, но не действуют на немодифицированную ДНК хозяина. Некоторые прокариоты разработали несколько типов систем рестрикционной модификации.
Системы RM более многочисленны у беспорядочных видов, где они устанавливают предпочтительные пути генетического обмена внутри и между линиями с родственными системами RM. [15] Поскольку репертуар и / или специфичность систем RM в бактериальных клонах быстро меняются, ожидается, что предпочтительные потоки генетического переноса внутри вида будут постоянно меняться, создавая зависящие от времени сети переноса генов.
Приложения
Молекулярная биология
(а) Клонирование: системы RM можно клонировать в плазмиды и выбирать из-за устойчивости, обеспечиваемой ферментом метилирования. Как только плазмида начинает реплицироваться, фермент метилирования будет продуцироваться и метилировать плазмидную ДНК, защищая ее от специфического фермента рестрикции.
(b) Полиморфизм длины рестрикционного фрагмента: рестрикционные ферменты также используются для анализа состава ДНК в отношении наличия или отсутствия мутаций, которые влияют на специфичность специфичности расщепления REase. При анализе генов дикого типа и мутантов путем переваривания различными RE-азами, гель-электрофоретические продукты различаются по длине, в основном потому, что мутантные гены не будут расщепляться по такому же образцу, как у дикого типа, на наличие мутаций, которые делают RE-азы неспецифичными. к мутантной последовательности.
Генная терапия
Система RM бактерий была предложена в качестве модели для разработки человеческих антивирусных генов или геномных вакцин и методов лечения, поскольку система RM выполняет врожденную защитную роль у бактерий, ограничивая тропизм бактериофагов. [16] Исследование на REases и ZFN , которые могут расщеплять ДНК различных вирусов человека, в том числе HSV-2 , с высокой степенью риска ВПЧ и ВИЧ-1 , с конечной целью индукции целевой мутагенез и аберраций вирусов человека заражение. [17] [18] [19] Человеческий геном уже содержит остатки ретровирусных геномов, которые были инактивированы и использованы для личной выгоды. Действительно, механизмы подавления активных ретроэлементов L1 генома с помощью трех первичных экзонуклеаз 1 репарации (TREX1) и перекрестного комплемента 1 репарации эксцизионной репарации (ERCC), по-видимому, имитируют действие RM-систем у бактерий и негомологичное соединение концов ( NHEJ), который следует за использованием ZFN без шаблона восстановления. [20] [21]
Основным достижением является создание искусственных рестрикционных ферментов, созданных путем связывания домена расщепления ДНК FokI с массивом ДНК-связывающих белков или массивов цинковых пальцев, которые теперь обозначаются как нуклеазы цинковых пальцев (ZFN). [22] ZFN являются мощным инструментом для редактирования генома хозяина из-за их повышенной специфичности последовательности. ZFN работают парами, их димеризация опосредуется in-situ через домен FoKI. Каждый массив цинковых пальцев (ZFA) способен распознавать 9-12 пар оснований, что составляет 18-24 пары. Спейсер 5-7 п.н. между сайтами расщепления дополнительно увеличивает специфичность ZFN, делая их безопасным и более точным инструментом, который можно применять у людей. Недавно было проведено клиническое испытание фазы I ZFN для целенаправленной отмены корецептора CCR5 для ВИЧ-1. [23]
Их связь с мобильными генетическими элементами (МГЭ)
Системы RM являются основными участниками коэволюционного взаимодействия между мобильными генетическими элементами (MGE) и их хозяевами. [24] Сообщалось, что гены, кодирующие системы RM, перемещаются между прокариотическими геномами внутри MGE, таких как плазмиды, профаги, инсерционные последовательности / транспозоны, интегративные конъюгативные элементы (ICE) и интегроны. Однако недавно было обнаружено, что систем РМ относительно мало в плазмидах, некоторые - в профагах и практически отсутствуют - в фагах. С другой стороны, все эти MGE кодируют большое количество одиночных генов RM, особенно МТаз. [24] В свете этого вполне вероятно, что подвижность RM может быть менее зависимой от MGEs и более зависимой, например, от существования небольших горячих точек геномной интеграции. Также возможно, что системы RM часто используют другие механизмы, такие как естественная трансформация, везикулы, нанотрубки, агенты переноса генов или обобщенная трансдукция, чтобы перемещаться между геномами.
Смотрите также
- Метилирование
- Фермент рестрикции
Рекомендации
- Перейти ↑ Luria SE, Human ML (1952). «Ненаследственные, вызванные хозяином вариации бактериальных вирусов» . J. Bacteriol . 64 (4): 557–69. DOI : 10.1128 / JB.64.4.557-569.1952 . PMC 169391 . PMID 12999684 .
- ^ Лурия С.Е. (1953). «Хозяин-индуцированные модификации вирусов». Харб Холодного источника. Symp. Quant. Биол . 18 : 237–44. DOI : 10.1101 / sqb.1953.018.01.034 . PMID 13168990 .
- ^ а б Сальватор Э. Лурия. Игровой автомат, сломанная пробирка: автобиография. Харпер и Роу, Нью-Йорк: 1984. Стр. 228. ISBN 0-06-015260-5 (США и Канада)
- ^ БЕРТАНИ Дж., Вейгл Дж. Дж. (1953). «Вариации, контролируемые хозяином в бактериальных вирусах» . J. Bacteriol . 65 (2): 113–21. DOI : 10.1128 / JB.65.2.113-121.1953 . PMC 169650 . PMID 13034700 .
- ^ ДЮССО Д, АРБЕР У (1962). «Хозяин-специфичность ДНК, продуцируемой Escherichia coli. II. Контроль принятия ДНК от заражающего фага лямбда». J. Mol. Биол . 5 : 37–49. DOI : 10.1016 / S0022-2836 (62) 80059-X . PMID 13888713 .
- ^ Натанс Д., Смит ХО (1975). «Эндонуклеазы рестрикции в анализе и реструктуризации молекул ДНК». Анну. Rev. Biochem . 44 : 273–93. DOI : 10.1146 / annurev.bi.44.070175.001421 . PMID 166604 .
- ^ Уилсон Г (1991). «Организация систем ограничения-модификации» . Исследования нуклеиновых кислот . 19 (10): 2539–2566. DOI : 10.1093 / NAR / 19.10.2539 . PMC 328170 . PMID 2041731 .
- ^ Уилсон Г (1991). «Системы ограничений и модификаций». Ежегодный обзор генетики . 25 : 585–627. DOI : 10.1146 / annurev.ge.25.120191.003101 . PMID 1812816 .
- ^ Лоенен WA (2013). «Другая сторона ограничения: ферменты, зависимые от модификации» . Исследования нуклеиновых кислот . 42 (1): 56–69. DOI : 10.1093 / NAR / gkt747 . PMC 3874153 . PMID 23990325 .
- ^ а б в Budroni S, Siena E, Dunning Hotopp JC, Seib KL, Serruto D, Nofroni C, Comanducci M, Riley DR, Daugherty SC, Angiuoli SV, Covacci A, Pizza M, Rappuoli R, Moxon ER, Tettelin H, Medini D (2011 г. ). «Neisseria meningitidis имеет структуру, связанную с системами рестрикционной модификации, которые модулируют гомологичную рекомбинацию» . Proc. Natl. Акад. Sci. США . 108 (11): 4494–9. Bibcode : 2011PNAS..108.4494B . DOI : 10.1073 / pnas.1019751108 . PMC 3060241 . PMID 21368196 .
- ^ Клаус Х, Фридрих А, Фрош М, Фогель У (2000). «Дифференциальное распространение новых систем рестрикции и модификации в клональных линиях Neisseria meningitidis» . J. Bacteriol . 182 (5): 1296–303. DOI : 10.1128 / jb.182.5.1296-1303.2000 . PMC 94415 . PMID 10671450 .
- ^ Амбур ОХ, Фрай С.А., Нильсен М., Ховланд Э., Тёнджум Т. (2012). «Ограничение и изменения последовательности влияют на трансформацию, зависимую от последовательности поглощения ДНК у Neisseria meningitidis» . PLOS ONE . 7 (7): e39742. Bibcode : 2012PLoSO ... 739742A . DOI : 10.1371 / journal.pone.0039742 . PMC 3388099 . PMID 22768309 .
- ^ Caugant DA, Maiden MC (2009). «Менингококковое носительство и болезнь - популяционная биология и эволюция» . Вакцина . 27 Приложение 2: B64–70. DOI : 10.1016 / j.vaccine.2009.04.061 . PMC 2719693 . PMID 19464092 .
- ^ Кусано К. (1995). «Системы рестрикции-модификации как геномные паразиты в конкуренции за определенные последовательности» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 92 (24): 11095–11099. Bibcode : 1995PNAS ... 9211095K . DOI : 10.1073 / pnas.92.24.11095 . PMC 40578 . PMID 7479944 .
- ^ Oliveira, Pedro H .; Тушон, Мари; Роча, Эдуардо ПК (2016-05-17). «Регулирование генетического обмена между бактериями с помощью систем рестрикции и модификации» . Труды Национальной академии наук . 113 (20): 5658–5663. Bibcode : 2016PNAS..113.5658O . DOI : 10.1073 / pnas.1603257113 . ISSN 0027-8424 . PMC 4878467 . PMID 27140615 .
- ^ Вайенгера М (2003). «ВИЧ и генная терапия: предлагаемая [ферментативная] модель RM для генной терапии против ВИЧ». Макерере Med J . 38 : 28–30.
- ^ Вайенгера М, Каджумбула Х, Бьяругаба В (2007). «Частота и картирование сайта расщепления последовательностей генов HIV-1 / SIVcpz, HIV-2 / SIVsmm и других SIV различными бактериальными ферментами рестрикции: предшественники нового продукта, ингибирующего ВИЧ». Afr J Biotechnol . 6 (10): 1225–1232.
- ^ Шиффер Дж. Т., Оберт М., Вебер Н. Д., Минцер Э, Стоун Д., Джером К. Р. (2012). «Целенаправленный мутагенез ДНК для лечения хронических вирусных инфекций» . Журнал вирусологии . 86 (17): 8920–36. DOI : 10,1128 / JVI.00052-12 . PMC 3416169 . PMID 22718830 .
- ^ Манджунатх Н., Йи Г, Данг Й, Шанкар П. (2013). «Новые технологии редактирования генов для генной терапии ВИЧ» . Вирусы . 5 (11): 2748–66. DOI : 10,3390 / v5112748 . PMC 3856413 . PMID 24284874 .
- ^ Стетсон ДБ, Ко Дж.С., Хайдманн Т, Меджитов Р (2008). «Trex1 предотвращает внутреннее инициирование клетками аутоиммунитета» . Cell . 134 (4): 587–598. DOI : 10.1016 / j.cell.2008.06.032 . PMC 2626626 . PMID 18724932 .
- ^ Гасиор С.Л., Рой-Энгель А.М., Дейнингер П.Л. (2008). «ERCC1 / XPF ограничивает ретротранспозицию L1» . Ремонт ДНК . 7 (6): 983–989. DOI : 10.1016 / j.dnarep.2008.02.006 . PMC 2483505 . PMID 18396111 .
- ^ Ким Ю.Г., Ча Дж., Чандрасегаран С. (февраль 1996 г.). «Гибридные рестрикционные ферменты: слияния цинковых пальцев с доменом расщепления Fok I» . Proc. Natl. Акад. Sci. США . 93 (3): 1156–60. Bibcode : 1996PNAS ... 93.1156K . DOI : 10.1073 / pnas.93.3.1156 . PMC 40048 . PMID 8577732 .
- ^ Тебас П., Штейн Д., Тан В.В., Фрэнк И., Ван С.К., Ли Джи и др. (2014). «Редактирование генов CCR5 в аутологичных CD4 Т-клетках людей, инфицированных ВИЧ» . N Engl J Med . 370 (10): 901–910. DOI : 10.1056 / NEJMoa1300662 . PMC 4084652 . PMID 24597865 .
- ^ а б Oliveira, PH; Touchon, M; Роча, EPC (2014). «Взаимодействие систем рестрикции-модификации с мобильными генетическими элементами и их прокариотическими хозяевами» . Nucleic Acids Res . 42 (16): 10618–10631. DOI : 10.1093 / NAR / gku734 . PMC 4176335 . PMID 25120263 .