Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску

Обратный Нозерн - блот представляет собой способ , с помощью которого паттерны экспрессии генов могут быть проанализированы путем сравнения выделенные молекулы РНК из образца тестера для образцов в контрольной кДНК библиотеки. Это вариант нозерн-блоттинга, в котором нуклеиновая кислота, иммобилизованная на мембране, представляет собой набор изолированных фрагментов ДНК, а не РНК , а зонд представляет собой РНК, выделенную из ткани и радиоактивно меченную. Обратный нозерн-блот может использоваться для профилирования уровней экспрессии определенных наборов последовательностей РНК в ткани или для определения присутствия конкретной последовательности РНК в образце. [1] Хотя ДНК-микрочипы и новые методы следующего поколения в основном вытеснили обратный нозерн-блоттинг, он все еще используется сегодня и обеспечивает относительно дешевый и простой способ определения экспрессии больших наборов генов.

Процедура [ править ]

Для получения обратной северной мембраны последовательности кДНК для представляющих интерес транскриптов иммобилизуют на нейлоновых мембранах, что может быть выполнено с помощью дот-блоттинга или двунаправленного блоттинга на агарозном геле и УФ-фиксации ДНК на мембранах. Во многих случаях зонды кДНК могут быть предпочтительнее зондов РНК, чтобы смягчить проблемы деградации РНК РНКазами или тканевыми метаболитами. [2] Подготовленные мембраны для обратного нозерн-блоттинга предварительно гибридизуют в растворе Денхардта с буфером SSC, а меченые кДНК-зонды денатурируют при 100 ° C и добавляют в раствор для предварительной гибридизации. Мембрану инкубируют с зондами не менее 15 часов при 65 ° C, затем промывают и экспонируют. [3]

Приложения [ править ]

Количественная оценка уровней экспрессии мРНК [ править ]

Общая процедура обратного нозерн-блоттинга с использованием кДНК из тестового образца и библиотеки SSH . Сверхэкспрессия транскриптов в образце тестера будет отображаться в виде более темных точек на мембране.

Обратный Нозерн-блот, как и Нозерн-блот, на котором он основан, используется для определения уровней экспрессии генов в определенных тканях. По сравнению с Нозерн-блоттингом обратный Нозерн-блот позволяет одновременно зондировать большое количество транскриптов с меньшей специфичностью в отношении зондов, чем требуется для Нозерн-блоттинга. [4] Часто это будет связано с использованием библиотек подавляющей субтрактивной гибридизации (SSH) или дифференциального отображения.для выделения дифференциально экспрессируемых транскриптов и создания бактериальных клонов, содержащих вставки для этих последовательностей. Они будут служить мишенями, гибридизованными с мембраной, и будут зондироваться образцом РНК. Уровни экспрессии можно количественно определить по увеличению или уменьшению флуоресцентного или радиоактивного сигнала по сравнению с контрольной обработкой. [3] Полосы или точки, которые кажутся более темными и крупными, означают транскрипты, которые чрезмерно экспрессируются в интересующем образце, а более светлые точки указывают на то, что транскрипт снижается по сравнению с контрольным образцом.

Подтверждение результатов дифференциального отображения [ править ]

Из-за тенденции генерировать большое количество ложных срабатываний, вызванных загрязнением полосы гетерогенными последовательностями, совпадения дифференциального отображения необходимо будет подтверждать альтернативным методом определения дифференциальной экспрессии. [5] Нозерн-блоттинг или q-ПЦРчасто используются для подтверждения результатов, оба метода имеют недостатки. Нозерн-блоттинг ограничен своей способностью исследовать только одну мРНК за раз, в то время как q-ПЦР требует, чтобы транскрипты были достаточно длинными, чтобы генерировать праймеры для последовательности, а зонды могут быть дорогостоящими. Таким образом, обратный северный термин использовался как одно из средств подтверждения совпадений с помощью DD-PCR или последовательностей с измененными уровнями экспрессии. В этом случае мембрана будет покрыта амплифицированными продуктами DD-PCR, которые были клонированы в векторы, секвенированы и повторно амплифицированы. [4]

Микромассивы ДНК [ править ]

ДНК-микроматрицы работают по процедурам, аналогичным тем, которые используются в обратном Нозерн-блоте, состоящем из множества ДНК-зондов, гибридизованных с твердым стеклянным, пластиковым или силиконовым субстратом, который зондируется меченой РНК или кДНК. Это позволяет значительно расширить профили экспрессии генов . [6] Массивы могут быть приобретены у коммерческих поставщиков с учетом исследовательских потребностей, например, микрочипов рака, клеточного цикла или токсикологии, или могут быть созданы для индивидуальных целей. [7] Флуоресцентные или радиоактивные сигналы, генерируемые гибридизацией изолированных образцов кДНК-зондов, будут пропорциональны распространенности транскрипта в исследуемой ткани. [8]

Приложения для исследований [ править ]

  • Обратный нозерн-блоттинг был использован в исследовании Gene в 2013 году, в котором автор идентифицировал ряд генов, ответственных за раннюю реакцию холодоустойчивости у морозостойких цитрусовых Poncirus trifoliata.Библиотеки супрессивной субтрактивной гибридизации были сформированы из обработанных холодом и контрольных растений, и клоны кДНК были секвенированы и гибридизированы с мембраной, которую зондировали с помощью меченной DIG кДНК как из контрольных, так и из обработанных холодом растений. Гены, в которых наблюдалась особенно сильная активация, включали гены спасения и защиты клеток, клеточного метаболизма и регуляции транскрипции. К ним относятся активаза оксигеназы рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы, которая регулирует фотосинтетический фермент RuBisCO, GAPDH, который участвует в гликолизе и ответе на окислительный стресс, а также белок контроля деления клеток CDC91 и ген устойчивости к заболеванию NBS-LLR. Затем эти результаты были подтверждены с помощью количественной ПЦР. [9]
  • В исследовании использовался метод определения различий в полосатом теле у крыс, получавших 3-NP, который часто используется в экспериментах для создания фенотипа, подобного болезни Хантингтона, у крыс. Вычитательную гибридизацию с прямым и обратным подавлением использовали для создания профилей гена с избыточной и недостаточной экспрессией, и эти библиотеки использовали для блоттинга двух мембран. Помимо сходных проявлений поражений в препарированном мозге крысы, группа наблюдала значительно повышенную экспрессию профилина-2 (Pfn2) в полосатом теле. Его сверхэкспрессия связана с уменьшением полимеризации актина и, как следствие, более низкой плотностью дендритных шипов. [10]

См. Также [ править ]

Ссылки [ править ]

  1. ^ Примроуз, Сэнди Б .; Твайман, Ричард (2009-04-01). Принципы геномного анализа и геномики . Джон Вили и сыновья. ISBN 9781444311280.
  2. ^ Jaakola, Лаура (2001). «КДНК-блоттинг предлагает альтернативный метод исследования экспрессии генов». Репортер по молекулярной биологии растений . 19 (2): 125–128. DOI : 10.1007 / BF02772154 .
  3. ^ a b Боулер, доктор Крис (01.01.2002). Молекулярная биология растений: практический подход . Издательство Оксфордского университета. ISBN 9780199638185.
  4. ^ a b Дилкс, Дэниел В; Кольцо, Роберт H; Khawaja, Xavier Z; Новак, Томас Дж; Астон, Кристофер (15 февраля 2003 г.). «Высокопроизводительное подтверждение результатов дифференциальной ПЦР с использованием обратного Нозерн-блоттинга». Журнал методов неврологии . 123 (1): 47–54. CiteSeerX 10.1.1.333.8554 . DOI : 10.1016 / S0165-0270 (02) 00343-6 . PMID 12581848 .  
  5. ^ Callard, D .; Lescure, B .; Маццолини, Л. (1994). «Метод устранения ложных срабатываний, генерируемых методом дифференциального отображения мРНК». Биотехнологии . 16 (6): 1096–7, 1100–3. PMID 7521188 . 
  6. ^ Томар, Rukam С. (2010-01-15). Молекулярные маркеры и биотехнология растений . Издательство Новой Индии. ISBN 9789380235257.
  7. ^ Курназ, Исил Аксан (2015-05-08). Методы генной инженерии . CRC Press. ISBN 9781482260908.
  8. ^ Offermanns, Стефан (2008-08-14). Энциклопедия молекулярной фармакологии . Springer Science & Business Media. ISBN 9783540389163.
  9. ^ Шахин-Чевик, Мехтап (2013-01-10). «Идентификация и анализ экспрессии ранних индуцированных холодом генов холодостойких родственников цитрусовых Poncirus trifoliata (L.) Raf». Джин . 512 (2): 536–545. DOI : 10.1016 / j.gene.2012.09.084 . PMID 23026217 . 
  10. ^ Chakraborty, J .; Панди, М .; Навнит, АК; Аппукуттан, TA; Varghese, M .; Сритама, Южная Каролина; Rajamma, U .; Моханакумар, КП (2014). «Профилин-2 увеличил экспрессию и его измененное взаимодействие с β-актином в полосатом теле при болезни Хантингтона, вызванной 3-нитропропионовой кислотой, у крыс». Неврология . 281 : 216–228. DOI : 10.1016 / j.neuroscience.2014.09.035 . PMID 25255934 . 

Внешние ссылки [ править ]

  • Протокол для дифференциального отображения, обратного северного и количественного ПЦР анализа экспрессии
  • скрининг разницы в экспрессии генов, обогащенный дифференциальным отображением
  • Презентация с описанием различных методов анализа экспрессии генов