Секвенирование отдельных клеток исследует информацию о последовательностях отдельных клеток с помощью оптимизированных технологий секвенирования следующего поколения (NGS), обеспечивая более высокое разрешение клеточных различий и лучшее понимание функции отдельной клетки в контексте ее микросреды. [1] Например, при раке секвенирование ДНК отдельных клеток может дать информацию о мутациях, переносимых небольшими популяциями клеток. В процессе разработки секвенирование РНК, экспрессируемых отдельными клетками, может дать представление о существовании и поведении различных типов клеток. [2]В микробных системах популяция одного и того же вида может казаться генетически клональной, но одноклеточное секвенирование РНК или эпигенетические модификации могут выявить межклеточную изменчивость, которая может помочь популяциям быстро адаптироваться к выживанию в изменяющейся среде. [3]
Задний план
Типичная человеческая клетка состоит примерно из 2 х 3,3 миллиарда пар оснований ДНК и 600 миллионов оснований мРНК. Обычно смесь миллионов клеток используется для секвенирования ДНК или РНК с использованием традиционных методов, таких как секвенирование по Сэнгеру или секвенирование Illumina . Используя глубокое секвенирование ДНК и РНК из одной клетки, можно всесторонне исследовать клеточные функции. [1] Как и в типичных экспериментах NGS, протоколы секвенирования отдельной клетки обычно содержат следующие этапы: выделение отдельной клетки, выделение и амплификация нуклеиновых кислот, подготовка библиотеки секвенирования, секвенирование и биоинформатический анализ данных. Секвенирование отдельных клеток является более сложной задачей по сравнению с секвенированием целых клеток. Минимальное количество исходных материалов из одной ячейки приводит к тому, что деградация, потеря образца и загрязнение оказывают заметное влияние на качество данных секвенирования. Кроме того, из-за пикограмм количества используемых нуклеиновых кислот [4] во время подготовки проб для секвенирования отдельных клеток часто требуется интенсивная амплификация, что приводит к неравномерному охвату, шуму и неточной количественной оценке данных секвенирования.
Последние технические улучшения делают секвенирование отдельных клеток многообещающим инструментом для решения ряда, казалось бы, недоступных проблем. Например, гетерогенные образцы, редкие типы клеток, взаимосвязь между клеточными линиями, мозаицизм соматических тканей, анализ микробов, которые нельзя культивировать, и эволюция болезни - все это можно выяснить с помощью секвенирования отдельных клеток. [5] Секвенирование отдельных клеток было выбрано Nature Publishing Group в качестве метода 2013 года. [6]
Секвенирование одноклеточного генома (ДНК)
Секвенирование генома одноклеточной ДНК включает выделение одной клетки, амплификацию всего генома или интересующей области, построение библиотек секвенирования, а затем применение секвенирования ДНК следующего поколения (например, Illumina , Ion Torrent , MGI ). В системах млекопитающих секвенирование одноклеточной ДНК широко применяется для изучения нормальной физиологии и болезней. Разрешение отдельных клеток может раскрыть роль генетического мозаицизма или внутриопухолевой генетической гетерогенности в развитии рака или ответе на лечение. [7] В контексте микробиомов геном одного одноклеточного организма называется единым амплифицированным геномом (SAG). Достижения в области секвенирования одноклеточной ДНК позволили собрать геномные данные от некультивируемых видов прокариот, присутствующих в сложных микробиомах. [8] Хотя SAG характеризуются низкой полнотой и значительным смещением, недавние вычислительные достижения позволили собрать почти полные геномы из составных SAG. [9] Данные, полученные от микроорганизмов, могут установить процессы культивирования в будущем. [10] Некоторые инструменты сборки генома, которые можно использовать при секвенировании генома одной клетки, включают: SPAdes , IDBA-UD, Cortex и HyDA. [11]
Методы
Опубликован список из более чем 100 различных методов омики отдельных ячеек . [12]
Многократная амплификация смещения (MDA) - широко используемый метод, позволяющий амплифицировать фемтограммы ДНК от бактерий до микрограммов для использования секвенирования. Реагенты, необходимые для реакций MDA, включают: случайные праймеры и ДНК-полимеразу из бактериофага phi29. При 30-градусной изотермической реакции ДНК амплифицируется с включенными реагентами. По мере того как полимеразы производят новые цепи, происходит реакция замещения цепи, в результате которой синтезируются несколько копий из каждой матричной ДНК. При этом вытянутые ранее нити будут смещены. Продукты MDA имеют длину около 12 т.п.н. и около 100 т.п.н., что позволяет использовать их при секвенировании ДНК. [10] В 2017 году в этот метод было внесено существенное усовершенствование, получившее название WGA-X, за счет использования термостабильного мутанта полимеразы phi29, что привело к лучшему извлечению генома из отдельных клеток, в частности из клеток с высоким содержанием G + C. . [13] MDA также был реализован в системе на основе микрожидкостных капель для достижения высоко распараллеленной амплификации полногенома одной клетки. Инкапсулируя отдельные клетки в капли для захвата и амплификации ДНК, этот метод обеспечивает снижение систематической ошибки и повышенную пропускную способность по сравнению с обычным MDA. [14]
Другой распространенный метод - МАЛЬБАК . [15] Этот метод начинается с изотермической амплификации, как это делается в MDA, но праймеры фланкируются «общей» последовательностью для последующей ПЦР-амплификации. По мере создания предварительных ампликонов общая последовательность способствует самолигированию и образованию «петель» для предотвращения дальнейшей амплификации. В отличие от MDA, сильно разветвленная сеть ДНК не образуется. Вместо этого в другом температурном цикле петли денатурируются, что позволяет амплифицировать фрагменты с помощью ПЦР. MALBAC также был реализован в микрожидкостном устройстве, но характеристики амплификации не были значительно улучшены за счет инкапсуляции в нанолитровые капли. [16]
Сравнивая MDA и MALBAC, MDA приводит к лучшему охвату генома, но MALBAC обеспечивает более равномерное покрытие по всему геному. MDA может быть более эффективным для идентификации SNP , тогда как MALBAC предпочтительнее для обнаружения вариантов количества копий. Хотя выполнение MDA с помощью микрофлюидного устройства заметно снижает смещение и загрязнение, химический состав MALBAC не демонстрирует такой же потенциал для повышения эффективности.
Метод, особенно подходящий для обнаружения структурных вариаций генома, представляет собой секвенирование цепи матрицы одноклеточной ДНК (также известное как Strand-seq). [17] Используя принцип одноклеточной трехканальной обработки, который использует совместное моделирование ориентации чтения, глубины чтения и фазы гаплотипа, Strand-seq позволяет обнаруживать полный спектр классов соматической структурной вариации ≥200kb в размер. Strand-seq преодолевает ограничения методов на основе полногеномной амплификации для идентификации классов соматических генетических вариаций в отдельных клетках [18], потому что он не чувствителен к химерам чтения, ведущим к вызывающим артефактам (подробно обсуждаемым в разделе ниже), и меньше пострадали от отсева. Выбор метода зависит от цели секвенирования, поскольку каждый метод имеет разные преимущества. [7]
Ограничения
MDA отдельных клеточных геномов приводит к сильно неравномерному покрытию генома, то есть к относительному перепредставлению и недопредставлению различных областей матрицы, что приводит к потере некоторых последовательностей. В этом процессе есть два компонента: а) стохастическое чрезмерное и недостаточное усиление случайных областей; и б) систематическая предвзятость в отношении регионов с высоким% GC. Стохастический компонент может быть устранен путем объединения одноклеточных реакций MDA из одного и того же типа клеток с использованием флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) и / или подтверждения после секвенирования. [10] Предвзятость MDA против областей с высоким% GC может быть устранена с помощью термостабильных полимераз, например, в процессе, называемом WGA-X. [13]
Однонуклеотидные полиморфизмы (SNP), которые являются большой частью генетической изменчивости в геноме человека , и вариация числа копий (CNV), создают проблемы при секвенировании отдельных клеток, а также ограниченное количество ДНК, извлеченное из одной клетки. Из-за небольшого количества ДНК точный анализ ДНК создает проблемы даже после амплификации, так как охват невелик и подвержен ошибкам. При использовании MDA средний охват генома составляет менее 80%, и SNP, не охваченные считыванием секвенирования, будут исключены. Кроме того, MDA показывает высокий коэффициент выпадения аллелей , не обнаруживая аллели из гетерозиготных образцов. В настоящее время используются различные алгоритмы SNP, но ни один из них не является специфичным для секвенирования отдельных клеток. MDA с CNV также создает проблему выявления ложных CNV, которые скрывают настоящие CNV. Чтобы решить эту проблему, когда шаблоны могут быть сгенерированы из ложных CNV, алгоритмы могут обнаруживать и устранять этот шум для создания истинных вариантов. [19]
Strand-seq преодолевает ограничения методов, основанных на амплификации всего генома для вызова генетических вариантов: поскольку Strand-seq не требует чтения (или пар чтения), пересекающих границы (или точки останова) CNV или классов структурных вариантов со сбалансированным копированием, это меньше восприимчивы к обычным артефактам одноклеточных методов, основанных на амплификации всего генома, которые включают выпадение вызова варианта из-за отсутствия считывания в точке останова варианта и считывания химеры. [7] [18] Strand-seq обнаруживает полный спектр классов структурных вариаций размером не менее 200 килобайт, включая циклы разрыва-слияния-моста и события хромотрипсиса , а также сбалансированные инверсии и сбалансированные или несбалансированные по количеству копий транслокации. [18] «Вызовы структурных вариантов, производимые Strand-seq, разрешаются гаплотипом по длине хромосомы , который обеспечивает дополнительную специфичность вызова вариантов. [18] В качестве текущего ограничения Strand-seq требует делящихся клеток для специфичной для цепи мечения с использованием бромдезоксиуридина (BrdU ), и этот метод не обнаруживает варианты размером менее 200 КБ, такие как вставки мобильных элементов .
Приложения
Микробиомы являются одной из основных мишеней геномики единичных клеток из-за сложности культивирования большинства микроорганизмов в большинстве сред. Одноклеточная геномика - мощный способ получения последовательностей микробного генома без культивирования. Этот подход широко применяется к морским, почвенным, подземным, организмным и другим типам микробиомов для решения широкого круга вопросов, связанных с микробной экологией, эволюцией, общественным здоровьем и потенциалом биотехнологии. [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28]
Секвенирование рака также является новым применением scDNAseq. Свежие или замороженные опухоли могут быть проанализированы и классифицированы в отношении SCNA, SNV и реаранжировок достаточно хорошо с использованием подходов полногеномных ДНК. [29] Рак scDNAseq особенно полезен для изучения глубины сложности и сложных мутаций, присутствующих в амплифицированных терапевтических мишенях, таких как гены рецепторной тирозинкиназы (EGFR, PDGFRA и т. Д.), Где традиционные подходы на уровне популяции к опухоли в объеме не могут разрешить паттерны совместного возникновения этих мутаций в отдельных клетках опухоли. Такое перекрытие может обеспечить избыточность активации пути и устойчивости опухолевых клеток.
Метиломное секвенирование одноклеточной ДНК
Секвенирование метилома одноклеточной ДНК позволяет количественно оценить метилирование ДНК . Существует несколько известных типов метилирования, которые происходят в природе, включая 5-метилцитозин (5mC), 5-гидрогиметилцитозин (5hmC), 6-метиладенин (6mA) и 4mC 4-метилцитозин (4mC). У эукариот, особенно животных, 5mC широко распространен по геному и играет важную роль в регуляции экспрессии генов путем репрессии мобильных элементов . [31] Секвенирование 5mC в отдельных клетках может показать, как эпигенетические изменения в генетически идентичных клетках одной ткани или популяции приводят к появлению клеток с разными фенотипами.
Методы
Бисульфитное секвенирование стало золотым стандартом в обнаружении и секвенировании 5mC в отдельных клетках. [32] Обработка ДНК бисульфитом превращает остатки цитозина в урацил, но не затрагивает остатки 5-метилцитозина. Следовательно, ДНК, обработанная бисульфитом, сохраняет только метилированные цитозины. Чтобы получить показание метилома, последовательность, обработанную бисульфитом, выравнивают с немодифицированным геномом. Полное геномное бисульфитное секвенирование было достигнуто в отдельных клетках в 2014 году. [33] Этот метод позволяет преодолеть потерю ДНК, связанную с типичной процедурой, когда адаптеры секвенирования добавляются до фрагментации бисульфита. Вместо этого адаптеры добавляются после обработки и фрагментации ДНК бисульфитом, что позволяет амплифицировать все фрагменты с помощью ПЦР. [34] Используя глубокое секвенирование, этот метод захватывает ~ 40% общего количества CpG в каждой клетке. При существующей технологии ДНК не может быть амплифицирована до обработки бисульфитом, поскольку метки 5mC не будут скопированы полимеразой.
Еще одним методом является бисульфитное секвенирование с пониженным представлением отдельных клеток (scRRBS). [35] Этот метод усиливает тенденцию метилированных цитозинов к кластеризации на островках CpG (CGI) для обогащения областей генома с высоким содержанием CpG. Это снижает стоимость секвенирования по сравнению с бисульфитным секвенированием всего генома, но ограничивает охват этого метода. Когда RRBS применяется к объемным образцам, обнаруживается большинство сайтов CpG в промоторах генов, но сайты в промоторах генов составляют только 10% сайтов CpG во всем геноме. [36] В отдельных клетках обнаруживается 40% сайтов CpG из основной массы образца. Для увеличения покрытия этот метод также можно применить к небольшому пулу отдельных ячеек. В образце из 20 объединенных единичных клеток было обнаружено 63% сайтов CpG из основной выборки. Объединение отдельных клеток - одна из стратегий увеличения охвата метиломом, но за счет сокрытия неоднородности в популяции клеток.
Ограничения
Хотя бисульфитное секвенирование остается наиболее широко используемым подходом для обнаружения 5mC, химическая обработка является жесткой и фрагментирует и разрушает ДНК. Этот эффект усиливается при переходе от объемных образцов к отдельным ячейкам. Другие методы обнаружения метилирования ДНК включают чувствительные к метилированию рестрикционные ферменты. Ферменты рестрикции также позволяют обнаруживать другие типы метилирования, такие как 6mA с DpnI. [37] Секвенирование на основе нанопор также предлагает путь прямого секвенирования метилирования без фрагментации или модификации исходной ДНК. Секвенирование нанопор использовалось для секвенирования метиломов бактерий, в которых преобладают 6mA и 4mC (в отличие от 5mC у эукариот), но этот метод еще не был применен к единичным клеткам. [38]
Приложения
Секвенирование метилирования ДНК одной клетки широко используется для изучения эпигенетических различий в генетически подобных клетках. Чтобы проверить эти методы во время их разработки, данные одноклеточного метилома смешанной популяции были успешно классифицированы с помощью иерархической кластеризации для идентификации различных типов клеток. [35] Другое приложение - изучение отдельных клеток во время первых нескольких делений клеток на раннем этапе развития, чтобы понять, как разные типы клеток возникают из одного эмбриона. [39] Одноклеточное полногеномное бисульфитное секвенирование также использовалось для изучения редких, но очень активных типов клеток рака, таких как циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК). [40]
Одноклеточный анализ хроматина, доступного для транспозаз, с секвенированием (scATAC-seq)
Секвенирование хроматина, доступного для транспозазы отдельных клеток, картирует доступность хроматина по всему геному. Транспозаза вставляет адаптеры секвенирования непосредственно в открытые области хроматина, что позволяет амплифицировать и секвенировать эти области. [41]
Секвенирование транскриптома одной клетки (scRNA-seq)
Стандартные методы , такие как микрочипы и объемной РНК-след анализа анализа экспрессии РНК из больших популяций клеток. В смешанных популяциях клеток эти измерения могут скрыть важные различия между отдельными клетками в этих популяциях. [42] [43]
Секвенирование одноклеточной РНК (scRNA-seq) обеспечивает профили экспрессии отдельных клеток и считается золотым стандартом для определения состояний и фенотипов клеток по состоянию на 2020 год. [44] Хотя невозможно получить полную информацию о каждой РНК, экспрессируемой с помощью в каждой клетке из-за небольшого количества доступного материала образцы экспрессии генов могут быть идентифицированы с помощью анализа кластеризации генов . [45] Это может раскрыть существование в клеточной популяции редких типов клеток, которые, возможно, никогда раньше не наблюдались. Например, редкие специализированные клетки в легких, называемые легочными ионоцитами, которые экспрессируют регулятор трансмембранной проводимости при муковисцидозе, были идентифицированы в 2018 году двумя группами, выполняющими scRNA-Seq на эпителии дыхательных путей легких. [46] [47]
Методы
Текущие протоколы scRNA-seq включают выделение отдельных клеток и их РНК, а затем выполнение тех же шагов, что и массовая последовательность RNA-seq: обратная транскрипция (RT), амплификация, создание библиотеки и секвенирование. Ранние методы разделяли отдельные клетки на отдельные лунки; Более современные методы инкапсулируют отдельные клетки в капельки в микрофлюидном устройстве, где происходит реакция обратной транскрипции, превращающая РНК в кДНК. Каждая капля несет «штрих-код» ДНК, который однозначно маркирует кДНК, полученные из одной клетки. После завершения обратной транскрипции кДНК из многих клеток можно смешать вместе для секвенирования; транскрипты из конкретной клетки идентифицируются уникальным штрих-кодом. [48] [49]
Проблемы для scRNA-Seq включают сохранение исходного относительного количества мРНК в клетке и идентификацию редких транскриптов. [50] Этап обратной транскрипции имеет решающее значение, поскольку эффективность реакции RT определяет, какая часть популяции РНК клетки будет в конечном итоге проанализирована секвенатором. Процессивность обратных транскриптаз и используемые стратегии прайминга могут влиять на продукцию полноразмерной кДНК и создание библиотек, смещенных к 3 'или 5' концам генов.
На этапе амплификации в настоящее время для амплификации кДНК используется либо ПЦР, либо транскрипция in vitro (IVT). Одним из преимуществ методов на основе ПЦР является возможность генерировать полноразмерную кДНК. Однако различная эффективность ПЦР для конкретных последовательностей (например, содержимого GC и структуры snapback) также может быть экспоненциально усилена, создавая библиотеки с неравномерным покрытием. С другой стороны, хотя библиотеки, созданные с помощью IVT, могут избежать смещения последовательности, вызванного ПЦР, конкретные последовательности могут транскрибироваться неэффективно, что вызывает выпадение последовательности или генерирование неполных последовательностей. [1] [42] Было опубликовано несколько протоколов scRNA-seq: Tang et al., [51] STRT, [52] SMART-seq, [53] CEL-seq, [54] RAGE-seq, [55] Quartz. -seq. [56] и C1-CAGE. [57] Эти протоколы различаются с точки зрения стратегий обратной транскрипции, синтеза и амплификации кДНК, а также возможности использования штрих-кодов, специфичных для последовательности (например, UMI ), или способности обрабатывать объединенные образцы. [58]
В 2017 году были внедрены два подхода для одновременного измерения экспрессии мРНК и белка в отдельных клетках с помощью меченных олигонуклеотидами антител, известных как REAP-seq, [59] и CITE-seq. [60]
Ограничения
Большинство методов RNA-Seq зависят от захвата поли (A) хвоста для обогащения мРНК и истощения обильной и неинформативной рРНК. Таким образом, они часто ограничиваются секвенированием молекул полиаденилированной мРНК. Однако недавние исследования начинают понимать важность неполи (А) РНК, такой как длинные некодирующие РНК и микроРНК, в регуляции экспрессии генов. Small-seq - это одноклеточный метод, который захватывает малые РНК (<300 нуклеотидов), такие как микроРНК, фрагменты тРНК и малые ядрышковые РНК в клетках млекопитающих. [61] В этом методе используется комбинация «олигонуклеотидных масок» (которые препятствуют захвату очень распространенных молекул 5,8S рРНК) и выбора размера для исключения крупных видов РНК, таких как другие очень распространенные молекулы рРНК. Для нацеливания на более крупные неполи (A) РНК, такие как длинная некодирующая мРНК, гистоновая мРНК, кольцевая РНК и энхансерная РНК, выбор размера не применим для истощения очень распространенных молекул рибосомной РНК (18S и 28s рРНК). [62] Одноклеточный RamDA-Seq - это метод, который достигает этого путем выполнения обратной транскрипции со случайным праймированием (амплификация со случайным смещением) в присутствии «не очень случайных» (NSR) праймеров, специально разработанных для предотвращения праймирования молекулы рРНК. [63] Хотя этот метод успешно захватывает полноразмерные транскрипты тотальной РНК для секвенирования и обнаруживает множество неполи (А) РНК с высокой чувствительностью, он имеет некоторые ограничения. Праймеры NSR были тщательно разработаны в соответствии с последовательностями рРНК в конкретном организме (мыши), и создание новых наборов праймеров для других видов потребует значительных усилий. Недавно основанный на CRISPR метод под названием scDASH (истощение обильных последовательностей одной клетки путем гибридизации) продемонстрировал другой подход к истощению последовательностей рРНК из библиотек тотальных последовательностей РНК одной клетки. [64]
Бактерии и другие прокариоты в настоящее время не поддаются секвенированию одноклеточной РНК из-за отсутствия полиаденилированной мРНК. Таким образом, разработка методов секвенирования РНК одной клетки, которые не зависят от захвата поли (A) хвоста, также будет способствовать проведению исследований микробиома с разрешением одной клетки. Массовые бактериальные исследования обычно применяют общее истощение рРНК, чтобы преодолеть недостаток полиаденилированной мРНК у бактерий, но на уровне одной клетки общая РНК, обнаруженная в одной клетке, слишком мала. [62] Отсутствие полиаденилированной мРНК и дефицит общей РНК, обнаруженные в отдельных бактериальных клетках, являются двумя важными препятствиями, ограничивающими использование scRNA-seq в бактериях.
Приложения
scRNA-Seq широко используется в биологических дисциплинах, включая биологию развития , [65] неврологию , [66] онкологию , [67] [68] [69] иммунологию , [70] [71] сердечно-сосудистые исследования [72] и инфекционные заболевания . [73] [74]
Используя методы машинного обучения , данные из массива RNA-Seq были использованы для увеличения отношения сигнал / шум в scRNA-Seq. В частности, ученые использовали профили экспрессии генов из наборов данных по раку для построения сетей коэкспрессии , а затем применили их к профилям экспрессии генов отдельных клеток, получив более надежный метод обнаружения мутаций в отдельных клетках с использованием уровней транскриптов. [75]
Некоторые методы scRNA-seq также применялись к одноклеточным микроорганизмам. SMART-seq2 использовался для анализа одноклеточных эукариотических микробов, но, поскольку он основан на захвате поли (A) хвоста, он не применялся в прокариотических клетках. [76] Микрожидкостные подходы, такие как Drop-seq и устройства Fluidigm IFC-C1, использовались для секвенирования отдельных паразитов малярии или отдельных дрожжевых клеток. [77] [78] Исследование одноклеточных дрожжей стремилось охарактеризовать гетерогенную устойчивость к стрессу в изогенных дрожжевых клетках до и после того, как дрожжи подвергаются солевому стрессу. Одноклеточный анализ нескольких факторов транскрипции с помощью scRNA-seq выявил гетерогенность в популяции. Эти результаты предполагают, что регулирование варьируется среди членов популяции, чтобы увеличить шансы на выживание для части населения.
Первый одноклеточный анализ транскриптома у прокариотических видов был проведен с использованием фермента терминатор экзонуклеазы для селективной деградации рРНК и амплификации мРНК по катящемуся кругу (RCA). [79] В этом методе концы одноцепочечной ДНК были лигированы вместе, чтобы сформировать круг, и полученная петля затем использовалась в качестве матрицы для линейной амплификации РНК. Библиотека конечного продукта была затем проанализирована с помощью микроматрицы с низким смещением и хорошим охватом. Однако RCA не тестировался с помощью RNA-seq, который обычно использует секвенирование следующего поколения. Последовательность одноклеточной РНК для бактерий была бы очень полезна для изучения микробиомов. Это позволит решить проблемы, встречающиеся в обычных подходах к массовой метатранскриптомике, такие как невозможность отловить виды, присутствующие в низкой численности, и неспособность устранить неоднородность среди популяций клеток.
scRNA-Seq обеспечил значительное понимание в развитие эмбрионов и организмов, в том числе червя Caenorhabditis Элеганс , [80] и регенеративного планарии Schmidtea Mediterranea [81] [82] и аксолотли Ambystoma mexicanum . [83] [84] Первыми позвоночными животными, которые были нанесены на карту таким образом, были рыбки данио [85] [86] [87] и Xenopus laevis . [88] В каждом случае изучались несколько стадий эмбриона, что позволяло картировать весь процесс развития на клеточной основе. Наука признала эти достижения прорывом 2018 года . [89]
Соображения
Изоляция одиночных ячеек
Есть несколько способов изолировать отдельные клетки перед амплификацией и секвенированием всего генома. Сортировка клеток с активацией флуоресценции (FACS) - широко используемый подход. Отдельные клетки также можно собирать с помощью микроманипуляций, например, путем серийного разведения или с помощью пипетки или нанотрубки для сбора одной клетки. [15] [90] Преимущества микроманипуляций - простота и низкая стоимость, но они трудоемки и подвержены ошибочной идентификации типов клеток под микроскопом. Микродиссекция с лазерным захватом (LCM) также может использоваться для сбора отдельных клеток. Хотя LCM сохраняет информацию о пространственном расположении выбранной клетки в ткани, трудно захватить целую отдельную клетку, не собрав также материалы из соседних клеток. [42] [91] [92] Высокопроизводительные методы выделения отдельных клеток также включают микрофлюидики . И FACS, и микрофлюидика являются точными, автоматическими и способны выделять несмещенные образцы. Однако оба метода требуют сначала отделения клеток от их микроокружения, тем самым вызывая нарушение профилей транскрипции при анализе экспрессии РНК. [93] [94]
Количество ячеек для анализа
scRNA-Seq
Вообще говоря, для типичного эксперимента по секвенированию РНК в массе клеток (RNA-seq) генерируется десять миллионов считываний, и ген с более высоким пороговым значением 50 прочтений на килобайт на миллион прочтений (RPKM) считается экспрессированным. Для гена длиной 1 Кбайт это соответствует 500 чтениям и минимальному коэффициенту вариации (CV) 4% в предположении распределения Пуассона . Для типичной клетки млекопитающего, содержащей 200000 мРНК, необходимо объединить данные секвенирования не менее 50 отдельных клеток, чтобы достичь этого минимального значения CV. Однако из-за эффективности обратной транскрипции и других шумов, вносимых в эксперименты, требуется больше клеток для точного анализа экспрессии и идентификации типа клеток. [42]
Смотрите также
- Одноклеточный анализ
- Одноклеточная транскриптомика
- Эпигеномика одиночных клеток
- Секвенирование ДНК
Рекомендации
- ^ a b c Eberwine J, Sul JY, Bartfai T, Kim J (январь 2014 г.). «Обещание секвенирования одной клетки». Природные методы . 11 (1): 25–7. DOI : 10.1038 / nmeth.2769 . PMID 24524134 . S2CID 11575439 .
- ^ Pennisi E (апрель 2018 г.). «Хронирование эмбрионов, клетка за клеткой, ген за геном». Наука . 360 (6387): 367. Bibcode : 2018Sci ... 360..367P . DOI : 10.1126 / science.360.6387.367 . PMID 29700246 .
- ^ Салиба А.Е., Вестерманн А.Дж., Горски С.А., Фогель Дж. (Август 2014 г.). «Single-cell RNA-seq: достижения и будущие проблемы» . Исследования нуклеиновых кислот . 42 (14): 8845–60. DOI : 10.1093 / NAR / gku555 . PMC 4132710 . PMID 25053837 .
- ^ Синтаку Х., Нишики Х., Маршалл Л.А., Котера Х., Сантьяго Дж. Дж. (Февраль 2014 г.). «Встроенное разделение и анализ РНК и ДНК из отдельных клеток». Аналитическая химия . 86 (4): 1953-7. DOI : 10.1021 / ac4040218 . PMID 24499009 .
- ^ Nawy T (январь 2014 г.). «Секвенирование одной клетки». Природные методы . 11 (1): 18. DOI : 10.1038 / nmeth.2771 . PMID 24524131 . S2CID 5252333 .
- ^ «Метод года 2013» . Природные методы . 11 (1): 1 января 2014 г. doi : 10.1038 / nmeth.2801 . PMID 24524124 .
- ^ а б в Гавад К., Ко В., Quake SR (март 2016 г.). «Секвенирование одноклеточного генома: современное состояние науки». Обзоры природы. Генетика . 17 (3): 175–88. DOI : 10.1038 / nrg.2015.16 . PMID 26806412 . S2CID 4800650 .
- ^ Алнеберг Дж., Карлссон С.М., Дивне А.М., Бергин С., Хома Ф., Линд М.В. и др. (Сентябрь 2018 г.). «Геномы некультивируемых прокариот: сравнение геномов, собранных в метагеноме, и геномов с однократной амплификацией» . Микробиом . 6 (1): 173. DOI : 10,1186 / s40168-018-0550-0 . PMC 6162917 . PMID 30266101 .
- ^ Когава М., Хосокава М., Нисикава Ю., Мори К., Такеяма Х. (февраль 2018 г.). «Получение высококачественных черновых геномов из некультивируемых микробов путем очистки и совместной сборки одноклеточных амплифицированных геномов» . Научные отчеты . 8 (1): 2059. Bibcode : 2018NatSR ... 8.2059K . DOI : 10.1038 / s41598-018-20384-3 . PMC 5794965 . PMID 29391438 .
- ^ а б в " Ласкен Р.С. (октябрь 2007 г.). «Одноклеточное геномное секвенирование с использованием множественного смещения амплификации». Текущее мнение в микробиологии . 10 (5): 510–6. DOI : 10.1016 / j.mib.2007.08.005 . PMID 17923430 ."
- ^ Taghavi Z, Movahedi NS, Draghici S, Chitsaz H (октябрь 2013 г.). «Дистиллированное секвенирование одноклеточного генома и сборка de novo для редких микробных сообществ» . Биоинформатика . 29 (19): 2395–401. arXiv : 1305.0062 . Bibcode : 2013arXiv1305.0062T . DOI : 10.1093 / биоинформатики / btt420 . PMC 3777112 . PMID 23918251 .
- ^ "Single-Cell-Omics.v2.3.13 @albertvilella" . Документы Google . Проверено 1 января 2020 .
- ^ а б Stepanauskas R, Fergusson EA, Brown J, Poulton NJ, Tupper B, Labonté JM, et al. (Июль 2017 г.). «Улучшенное восстановление генома и интегрированный анализ размера отдельных некультивируемых микробных клеток и вирусных частиц» . Nature Communications . 8 (1): 84. Bibcode : 2017NatCo ... 8 ... 84S . DOI : 10.1038 / s41467-017-00128-Z . PMC 5519541 . PMID 28729688 .
- ^ Хосокава М., Нисикава Ю., Когава М., Такеяма Н. (июль 2017 г.). «Массивно параллельная амплификация всего генома для секвенирования одной клетки с использованием капельной микрофлюидики» . Научные отчеты . 7 (1): 5199. Bibcode : 2017NatSR ... 7.5199H . DOI : 10.1038 / s41598-017-05436-4 . PMC 5507899 . PMID 28701744 .
- ^ а б Zong C, Lu S, Chapman AR, Xie XS (декабрь 2012 г.). «Общегеномное обнаружение однонуклеотидных вариаций и вариаций числа копий одной клетки человека» . Наука . 338 (6114): 1622–6. Bibcode : 2012Sci ... 338.1622Z . DOI : 10.1126 / science.1229164 . PMC 3600412 . PMID 23258894 .
- ^ Ю З, Лу С., Хуанг И (октябрь 2014 г.). «Микрожидкостное устройство для амплификации всего генома для секвенирования отдельных клеток». Аналитическая химия . 86 (19): 9386–90. DOI : 10.1021 / ac5032176 . PMID 25233049 .
- ^ Фалконер, Эстер; Холмы, Марк; Науманн, Ульрике; Пун, Стивен СС; Чавес, Элизабет А; Сандерс, Эшли Д.; Чжао, Юнцзюнь; Херст, Мартин; Лансдорп, Питер М. (7 октября 2012 г.). «Секвенирование цепи ДНК-матрицы единичных клеток картирует геномные перестройки с высоким разрешением» . Природные методы . 9 (11): 1107–1112. DOI : 10.1038 / nmeth.2206 . PMC 3580294 . PMID 23042453 .
- ^ а б в г " Сандерс А.Д., Мейерс С., Грегани М., Порубски Д., Йонг Х., ван Влит М.А., Рауш Т., Рихтер-Печаньска П., Кунц Дж. Б., Дженни С., Болоньини Д., Лонго Г. М., Редер Б., Кинанен В., Циммерманн Дж., Бенеш В. , Schrappe M, Mardin BR, Kulozik AE, Bornhauser B, Bourquin JP, Marschall T, Korbel JO (март 2020 г.). «Одноячеечный анализ структурных вариаций и сложных перестроек с трехканальной обработкой» (PDF) . Nat Biotechnol . 38 (3): 343–354. DOI : 10.1038 / s41587-019-0366-х . PMID 31873213 . S2CID 209464011 ."
- ^ " Нин Л., Лю Дж, Ли Дж, Хоу И, Тонг И, Хе Дж (2014). «Актуальные проблемы биоинформатики геномики единичных клеток» . Границы онкологии . 4 (7): 7. DOI : 10,3389 / fonc.2014.00007 . PMC 3902584 . PMID 24478987 ."
- ^ Blainey PC, Quake SR (январь 2014 г.). «Анализ геномного разнообразия, по одной клетке за раз» . Природные методы . 11 (1): 19–21. DOI : 10.1038 / nmeth.2783 . hdl : 1721,1 / 106574 . PMC 3947563 . PMID 24524132 .
- ^ Чжан К., Мартини А.С., Реппас Н.Б., Барри К.В., Малек Дж., Чизхолм С.В., Церковный генеральный директор (июнь 2006 г.). «Секвенирование геномов из отдельных клеток путем клонирования полимеразы». Природа Биотехнологии . 24 (6): 680–6. DOI : 10.1038 / nbt1214 . PMID 16732271 . S2CID 2994579 .
- ^ Юн Х.С., Прайс Д.С., Степанаускас Р., Раджа В.Д., Сераки М.Э., Уилсон У.Х. и др. (Май 2011 г.). «Одноклеточная геномика выявляет организменные взаимодействия у некультивируемых морских простейших». Наука . 332 (6030): 714–7. Bibcode : 2011Sci ... 332..714Y . DOI : 10.1126 / science.1203163 . PMID 21551060 . S2CID 34343205 .
- ^ Свон Б.К., Мартинес-Гарсия М., Престон С.М., Ширба А., Войке Т., Лами Д. и др. (Сентябрь 2011 г.). «Возможность хемолитоавтотрофии среди вездесущих клонов бактерий в темном океане». Наука . 333 (6047): 1296–300. Bibcode : 2011Sci ... 333.1296S . DOI : 10.1126 / science.1203690 . PMID 21885783 . S2CID 206533092 .
- ^ Woyke T, Xie G, Copeland A, González JM, Han C, Kiss H и др. (2009-04-23). «Сборка морского метагенома, по одной клетке за раз» . PLOS ONE . 4 (4): e5299. Bibcode : 2009PLoSO ... 4.5299W . DOI : 10.1371 / journal.pone.0005299 . PMC 2668756 . PMID 19390573 .
- ^ Свон Б.К., Таппер Б., Ширба А., Лауро Ф.М., Мартинес-Гарсия М., Гонсалес Дж. М. и др. (Июль 2013). «Преобладающая оптимизация генома и широтная дивергенция планктонных бактерий на поверхности океана» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 110 (28): 11463–8. Bibcode : 2013PNAS..11011463S . DOI : 10.1073 / pnas.1304246110 . PMC 3710821 . PMID 23801761 .
- ^ Ринке С., Швентек П., Ширба А., Иванова Н.Н., Андерсон И.Дж., Ченг Дж.Ф. и др. (Июль 2013). «Понимание филогении и кодирующего потенциала микробной темной материи» (PDF) . Природа . 499 (7459): 431–7. Bibcode : 2013Natur.499..431R . DOI : 10,1038 / природа12352 . PMID 23851394 . S2CID 4394530 .
- ^ Каштан Н., Роггенсак С.Е., Родриг С., Томпсон Дж. У., Биллер С. Дж., Коу А. и др. (Апрель 2014 г.). «Одноклеточная геномика выявляет сотни сосуществующих субпопуляций дикого Prochlorococcus». Наука . 344 (6182): 416–20. Bibcode : 2014Sci ... 344..416K . DOI : 10.1126 / science.1248575 . hdl : 1721,1 / 92763 . PMID 24763590 . S2CID 13659345 .
- ^ Pachiadaki MG, Sintes E, Bergauer K, Brown JM, Record NR, Swan BK и др. (Ноябрь 2017 г.). «Основная роль нитритокисляющих бактерий в фиксации углерода темного океана» . Наука . 358 (6366): 1046–1051. Bibcode : 2017Sci ... 358.1046P . DOI : 10.1126 / science.aan8260 . PMID 29170234 .
- ^ Francis JM, Zhang CZ, Maire CL, Jung J, Manzo VE, Adalsteinsson VA и др. (Август 2014 г.). «Неоднородность варианта EGFR в глиобластоме решена посредством одноядерного секвенирования» . Открытие рака . 4 (8): 956–71. DOI : 10.1158 / 2159-8290.CD-13-0879 . PMC 4125473 . PMID 24893890 .
- ^ Фарлик М., Шеффилд, Северная Каролина, Нуццо А., Датлингер П., Шёнеггер А., Клугаммер Дж., Бок С. (март 2015 г.). «Секвенирование метилома одноклеточной ДНК и биоинформатический вывод динамики эпигеномных состояний клеток» . Отчеты по ячейкам . 10 (8): 1386–97. DOI : 10.1016 / j.celrep.2015.02.001 . PMC 4542311 . PMID 25732828 .
- ^ Земах А., Макдэниел И.Е., Сильва П., Зильберман Д. (май 2010 г.). «Полногеномный эволюционный анализ метилирования эукариотической ДНК» . Наука . 328 (5980): 916–9. Bibcode : 2010Sci ... 328..916Z . DOI : 10.1126 / science.1186366 . PMID 20395474 . S2CID 206525166 .
- ^ Crary-Dooley FK, Tam ME, Dunaway KW, Hertz-Picciotto I, Schmidt RJ, LaSalle JM (март 2017 г.). «Сравнение существующих глобальных анализов метилирования ДНК с секвенированием бисульфита полного генома с низким охватом для эпидемиологических исследований» . Эпигенетика . 12 (3): 206–214. DOI : 10.1080 / 15592294.2016.1276680 . PMC 5406214 . PMID 28055307 .
- ^ Смоллвуд С.А., Ли Х.Дж., Ангермюллер С., Крюгер Ф., Сааде Х., Пит Дж. И др. (Август 2014 г.). «Одноклеточное бисульфитное секвенирование всего генома для оценки эпигенетической гетерогенности» . Природные методы . 11 (8): 817–820. DOI : 10,1038 / Nmeth.3035 . PMC 4117646 . PMID 25042786 .
- ^ Миура Ф., Эномото Ю., Дайрики Р., Ито Т. (сентябрь 2012 г.). «Полное геномное бисульфитное секвенирование без амплификации с помощью постбисульфитного адаптера» . Исследования нуклеиновых кислот . 40 (17): e136. DOI : 10.1093 / NAR / gks454 . PMC 3458524 . PMID 22649061 .
- ^ а б Го Х, Чжу П, Ву Х, Ли Х, Вэнь Л., Тан Ф (декабрь 2013 г.). «Одноклеточные метиломные пейзажи эмбриональных стволовых клеток мыши и ранних эмбрионов проанализированы с использованием бисульфитного секвенирования с пониженным представлением» . Геномные исследования . 23 (12): 2126–35. DOI : 10.1101 / gr.161679.113 . PMC 3847781 . PMID 24179143 .
- ^ Гу Х, Смит З.Д., Бок С., Бойл П., Гнирке А., Мейснер А. (апрель 2011 г.). «Подготовка библиотек секвенирования бисульфита с уменьшенным представлением для профилирования метилирования ДНК в масштабе генома». Протоколы природы . 6 (4): 468–81. DOI : 10.1038 / nprot.2010.190 . PMID 21412275 . S2CID 24912438 .
- ^ Fu Y, Luo GZ, Chen K, Deng X, Yu M, Han D и др. (Май 2015 г.). «N6-метилдеоксиаденозин отмечает активные сайты начала транскрипции у хламидомонады» . Cell . 161 (4): 879–892. DOI : 10.1016 / j.cell.2015.04.010 . PMC 4427561 . PMID 25936837 .
- ^ Больорье Дж., Шадт Э., Фанг Дж. (Март 2019 г.). «Расшифровка бактериальных эпигеномов с использованием современных технологий секвенирования» . Обзоры природы. Генетика . 20 (3): 157–172. DOI : 10.1038 / s41576-018-0081-3 . PMC 6555402 . PMID 30546107 .
- ^ Го Х, Чжу П, Ян Л., Ли Р, Ху Б, Лиан И и др. (Июль 2014 г.). «Пейзаж метилирования ДНК ранних эмбрионов человека». Природа . 511 (7511): 606–10. Bibcode : 2014Natur.511..606G . DOI : 10,1038 / природа13544 . PMID 25079557 . S2CID 4450377 .
- ^ Gkountela S, Castro-Giner F, Szczerba BM, Vetter M, Landin J, Scherrer R, et al. (Январь 2019). «Кластеризация циркулирующих опухолевых клеток формирует метилирование ДНК для обеспечения посева метастазов» . Cell . 176 (1–2): 98–112.e14. DOI : 10.1016 / j.cell.2018.11.046 . PMC 6363966 . PMID 30633912 .
- ^ Stein RA (1 июля 2019 г.). «Секвенирование отдельных клеток через множественные омики» . Проверено 1 августа 2019 .
- ^ а б в г " Шапиро Э., Бизунер Т., Линнарссон С. (сентябрь 2013 г.). «Технологии, основанные на секвенировании отдельных клеток, произведут революцию в науке о целом организме». Обзоры природы. Генетика . 14 (9): 618–30. DOI : 10,1038 / nrg3542 . PMID 23897237 . S2CID 500845 ."
- ^ Колодзейчик А.А., Ким Дж. К., Свенссон В., Мариони Дж. К., Тейхманн С.А. (май 2015 г.). «Технология и биология секвенирования одноклеточной РНК» . Молекулярная клетка . 58 (4): 610–20. DOI : 10.1016 / j.molcel.2015.04.005 . PMID 26000846 .
- ^ Таммела, Туомас; Мудрец, Жюльен (2020). «Изучение неоднородности опухоли в моделях мышей» . Ежегодный обзор биологии рака . 4 : 99–119. DOI : 10,1146 / annurev-cancerbio-030419-033413 .
- ^ Харрис, Крис (2020). Анализ транскриптома одиночных клеток при раке простаты (MSc). Университет Отаго. hdl : 10523/10111 .
- ^ Montoro DT, Haber AL, Biton M, Vinarsky V, Lin B, Birket SE и др. (Август 2018). «Пересмотренная иерархия эпителия дыхательных путей включает ионоциты, экспрессирующие CFTR» . Природа . 560 (7718): 319–324. Bibcode : 2018Natur.560..319M . DOI : 10.1038 / s41586-018-0393-7 . PMC 6295155 . PMID 30069044 .
- ^ Plasschaert LW, Žilionis R, Choo-Wing R, Savova V, Knehr J, Roma G и др. (Август 2018). «Одноклеточный атлас эпителия дыхательных путей показывает богатые CFTR легочные ионоциты» . Природа . 560 (7718): 377–381. Bibcode : 2018Natur.560..377P . DOI : 10.1038 / s41586-018-0394-6 . PMC 6108322 . PMID 30069046 .
- ^ Кляйн А.М., Мазутис Л., Акартуна I, Таллапрагада Н., Верес А., Ли В. и др. (Май 2015 г.). «Капельное штрих-кодирование одноклеточной транскриптомики, применяемое к эмбриональным стволовым клеткам» . Cell . 161 (5): 1187–1201. DOI : 10.1016 / j.cell.2015.04.044 . PMC 4441768 . PMID 26000487 .
- ^ Макоско Э.З., Басу А., Сатия Р., Немеш Дж., Шекхар К., Голдман М. и др. (Май 2015 г.). «Профилирование экспрессии отдельных клеток с высокой параллельностью генома с использованием капель нанолитера» . Cell . 161 (5): 1202–1214. DOI : 10.1016 / j.cell.2015.05.002 . PMC 4481139 . PMID 26000488 .
- ^ " Hebenstreit D (ноябрь 2012 г.). «Методы, проблемы и возможности одноклеточной РНК-seq» . Биология . 1 (3): 658–67. DOI : 10.3390 / biology1030658 . PMC 4009822 . PMID 24832513 ."
- ^ Тан Ф., Барбачору С., Ван Й., Нордман Э., Ли С., Сюй Н. и др. (Май 2009 г.). «Анализ целого транскриптома мРНК-Seq отдельной клетки». Природные методы . 6 (5): 377–82. DOI : 10.1038 / NMETH.1315 . PMID 19349980 . S2CID 16570747 .
- ^ Ислам С., Кьеллквист Ю., Молинер А., Заяц П., Фан Дж. Б., Лённерберг П., Линнарссон С. (июль 2011 г.). «Характеристика одноклеточного транскрипционного ландшафта с помощью высоко мультиплексной РНК-seq» . Геномные исследования . 21 (7): 1160–7. DOI : 10.1101 / gr.110882.110 . PMC 3129258 . PMID 21543516 .
- ^ Рамскельд Д., Луо С., Ван Ю.С., Ли Р., Дэн К., Фаридани О.Р. и др. (Август 2012 г.). «Полноразмерная мРНК-Seq из одноклеточных уровней РНК и отдельных циркулирующих опухолевых клеток» . Природа Биотехнологии . 30 (8): 777–82. DOI : 10.1038 / nbt.2282 . PMC 3467340 . PMID 22820318 .
- ^ Хашимшони Т., Вагнер Ф, Шер Н, Янаи И. (сентябрь 2012 г.). «CEL-Seq: одноклеточная РНК-Seq путем мультиплексной линейной амплификации» . Отчеты по ячейкам . 2 (3): 666–73. DOI : 10.1016 / j.celrep.2012.08.003 . PMID 22939981 .
- ^ Сингх М., Аль-Эриани Дж., Карсуэлл С., Фергюсон Дж. М., Блэкберн Дж., Бартон К. и др. (Июль 2019 г.). «Высокопроизводительное целевое долгосрочное секвенирование отдельных клеток выявляет клональный и транскрипционный ландшафт лимфоцитов» . Nature Communications . 10 (1): 3120. Bibcode : 2019NatCo..10.3120S . DOI : 10.1038 / s41467-019-11049-4 . PMC 6635368 . PMID 31311926 .
- ^ Сасагава Ю., Никайдо И., Хаяси Т., Данно Х., Уно К.Д., Имаи Т., Уэда Х.Р. (апрель 2013 г.). «Quartz-Seq: высоко воспроизводимый и чувствительный метод секвенирования одноклеточной РНК, выявляющий негенетическую гетерогенность экспрессии генов» . Геномная биология . 14 (4): R31. DOI : 10.1186 / GB-2013-14-4-R31 . PMC 4054835 . PMID 23594475 .
- ^ Куно Т., Муди Дж., Квон А.Т., Шибаяма Ю., Като С., Хуанг И. и др. (Январь 2019). «C1 CAGE определяет сайты начала транскрипции и активность энхансера при разрешении одной клетки» . Nature Communications . 10 (1): 360. Bibcode : 2019NatCo..10..360K . DOI : 10.1038 / s41467-018-08126-5 . PMC 6341120 . PMID 30664627 .
- ^ Даль Молин А., Ди Камилло Б. (июль 2019 г.). «Как разработать эксперимент по секвенированию одноклеточной РНК: подводные камни, проблемы и перспективы». Брифинги по биоинформатике . 20 (4): 1384–1394. DOI : 10.1093 / нагрудник / bby007 . PMID 29394315 .
- ^ Петерсон В.М., Чжан К.Х., Кумар Н., Вонг Дж., Ли Л., Уилсон Д.К. и др. (Октябрь 2017 г.). «Мультиплексное количественное определение белков и транскриптов в отдельных клетках». Природа Биотехнологии . 35 (10): 936–939. DOI : 10.1038 / nbt.3973 . PMID 28854175 . S2CID 205285357 .
- ^ Stoeckius M, Hafemeister C, Stephenson W, Houck-Loomis B, Chattopadhyay PK, Swerdlow H, et al. (Сентябрь 2017 г.). «Одновременное измерение эпитопа и транскриптома в отдельных клетках» . Природные методы . 14 (9): 865–868. DOI : 10.1038 / nmeth.4380 . PMC 5669064 . PMID 28759029 .
- ^ Хагеманн-Йенсен М., Абдуллаев И., Сандберг Р., Фаридани О.Р. (октябрь 2018 г.). «Small-seq для секвенирования малой РНК одной клетки». Протоколы природы . 13 (10): 2407–2424. DOI : 10.1038 / s41596-018-0049-у . PMID 30250291 . S2CID 52813142 .
- ^ а б Хаяси Т., Одзаки Х., Сасагава Й., Умеда М., Данно Х., Никайдо I. (февраль 2018 г.). «Одноклеточное полноразмерное секвенирование тотальной РНК раскрывает динамику рекурсивного сплайсинга и энхансерных РНК» . Nature Communications . 9 (1): 619. Bibcode : 2018NatCo ... 9..619H . DOI : 10.1038 / s41467-018-02866-0 . PMC 5809388 . PMID 29434199 .
- ^ Armor CD, Castle JC, Chen R, Babak T, Loerch P, Jackson S и др. (Сентябрь 2009 г.). «Цифровое профилирование транскриптома с использованием селективного прайминга гексамеров для синтеза кДНК». Природные методы . 6 (9): 647–9. DOI : 10.1038 / nmeth.1360 . PMID 19668204 . S2CID 12164981 .
- ^ Loi, Danson SC; Ю, Лэй; Ву, Анджела Р. (15.01.2021). «Эффективное истощение рибосомной РНК для одноклеточной общей РНК-seq с помощью scDASH» . PeerJ . 9 : e10717. DOI : 10,7717 / peerj.10717 . ISSN 2167-8359 . PMC 7812930 . PMID 33520469 .
- ^ Гриффитс, Дж. А; Scialdone, A; Мариони, JC (16 апреля 2018 г.). «Использование одноклеточной геномики для понимания процессов развития и решений клеточной судьбы» . Молекулярная системная биология . 14 (4): e8046. DOI : 10.15252 / msb.20178046 . PMC 5900446 . PMID 29661792 .
- ^ Радж Б., Вагнер Д.Е., Маккенна А., Пандей С., Кляйн А.М., Шендур Дж. И др. (Июнь 2018). «Одновременное одноклеточное профилирование клонов и типов клеток в головном мозге позвоночных» . Природа Биотехнологии . 36 (5): 442–450. DOI : 10.1038 / nbt.4103 . PMC 5938111 . PMID 29608178 .
- ^ Olmos D, Arkenau HT, Ang JE, Ledaki I, Attard G, Carden CP и др. (Январь 2009 г.). «Циркулирующие опухолевые клетки (ЦКО) считаются промежуточными конечными точками при устойчивом к кастрации раке простаты (CRPC): одноцентровое исследование» . Анналы онкологии . 20 (1): 27–33. DOI : 10.1093 / annonc / mdn544 . PMID 18695026 .
- ^ Левитин Х.М., Юань Дж., Sims PA (апрель 2018 г.). "Одноклеточный транскриптомный анализ неоднородности опухоли" . Тенденции рака . 4 (4): 264–268. DOI : 10.1016 / j.trecan.2018.02.003 . PMC 5993208 . PMID 29606308 .
- ^ Джерби-Арнон Л., Шах П., Куоко М.С., Родман С., Су М.Дж., Мелмс Дж.С. и др. (Ноябрь 2018 г.). «Программа раковых клеток способствует исключению Т-клеток и устойчивости к блокаде контрольных точек» . Cell . 175 (4): 984–997.e24. DOI : 10.1016 / j.cell.2018.09.006 . PMC 6410377 . PMID 30388455 .
- ^ Neu, KE; Тан, Q; Уилсон, ПК; Хан, А.А. (февраль 2017 г.). "Одноклеточная геномика: подходы и применение в иммунологии" . Тенденции в иммунологии . 38 (2): 140–149. DOI : 10.1016 / j.it.2016.12.001 . PMC 5479322 . PMID 28094102 .
- ^ Стивенсон В., Донлин Л.Т., Батлер А., Розо С., Бракен Б., Рашидфаррохи А. и др. (Февраль 2018). «Одноклеточная РНК-последовательность синовиальной ткани при ревматоидном артрите с использованием недорогих микрофлюидных инструментов» . Nature Communications . 9 (1): 791. Bibcode : 2018NatCo ... 9..791S . DOI : 10.1038 / s41467-017-02659-х . PMC 5824814 . PMID 29476078 .
- ^ Куппе, Кристоф; Ибрагим, Махмуд М .; Кранц, Дженнифер; Чжан, Сяотин; Зиглер, Сюзанна; Пералес-Патон, Хавьер; Янсен, Джитске; Reimer, Katharina C .; Смит, Джеймс Р .; Доби, Росс; Уилсон-Канамари, Джон Р. (11.11.2020). «Расшифровка происхождения миофибробластов при фиброзе почек человека» . Природа . 589 (7841): 281–286. DOI : 10.1038 / s41586-020-2941-1 . ISSN 1476-4687 . PMID 33176333 . S2CID 226309826 .
- ^ Avraham R, Haseley N, Brown D, Penaranda C, Jijon HB, Trombetta JJ и др. (Сентябрь 2015 г.). «Изменчивость патогенов от клетки к клетке приводит к неоднородности иммунных ответов хозяина» . Cell . 162 (6): 1309–21. DOI : 10.1016 / j.cell.2015.08.027 . PMC 4578813 . PMID 26343579 .
- ^ Боссель Бен-Моше Н., Хен-Авиви С., Левитин Н., Йехезкель Д., Остинг М., Йоостен Л.А. и др. (Июль 2019 г.). «Прогнозирование исходов бактериальной инфекции с использованием анализа секвенирования одноклеточной РНК иммунных клеток человека» . Nature Communications . 10 (1): 3266. Bibcode : 2019NatCo..10.3266B . DOI : 10.1038 / s41467-019-11257-у . PMC 6646406 . PMID 31332193 .
- ^ Меркателли, Даниэле; Луч, Лес; Джорджи, Федерико М. (2019). «Пан-рак и одноклеточное моделирование геномных изменений посредством экспрессии генов» . Границы генетики . 10 : 671. DOI : 10,3389 / fgene.2019.00671 . ISSN 1664-8021 . PMC 6657420 . PMID 31379928 .
- ^ Reid AJ, Talman AM, Bennett HM, Gomes AR, Sanders MJ, Illingworth CJ и др. (Март 2018 г.). «Single-cell RNA-seq выявляет скрытые транскрипционные вариации у малярийных паразитов» . eLife . 7 : e33105. DOI : 10.7554 / eLife.33105 . PMC 5871331 . PMID 29580379 .
- ^ Поран А., Нётцель С., Али О, Менсия-Тринчант Н., Харрис К.Т., Гусман М.Л. и др. (Ноябрь 2017 г.). «Секвенирование одноклеточной РНК показывает признак сексуальной приверженности малярийных паразитов» . Природа . 551 (7678): 95–99. Bibcode : 2017Natur.551 ... 95P . DOI : 10.1038 / nature24280 . PMC 6055935 . PMID 29094698 .
- ^ Гаш А.П., Ю. Ф. Б., Хосе Дж., Эскаланте Л. Э., Плейс М, Бахер Р. и др. (Декабрь 2017 г.). Балабан Н (ред.). «Секвенирование одноклеточной РНК выявляет внутреннюю и внешнюю регуляторную гетерогенность дрожжей, реагирующих на стресс» . PLOS Биология . 15 (12): e2004050. DOI : 10.1371 / journal.pbio.2004050 . PMC 5746276 . PMID 29240790 .
- ^ Канг Й., Норрис М.Х., Заржицки-Сик Дж., Нирман В.К., Доначи С.П., Хоанг Т.Т. (июнь 2011 г.). «Амплификация транскрипта из одной бактерии для анализа транскриптома» . Геномные исследования . 21 (6): 925–35. DOI : 10.1101 / gr.116103.110 . PMC 3106325 . PMID 21536723 .
- ^ Цао Дж., Пакер Дж. С., Рамани В., Кусанович Д. А., Хюин С., Даза Р. и др. (Август 2017 г.). «Комплексное одноклеточное транскрипционное профилирование многоклеточного организма» . Наука . 357 (6352): 661–667. Bibcode : 2017Sci ... 357..661C . DOI : 10.1126 / science.aam8940 . PMC 5894354 . PMID 28818938 .
- ^ Plass M, Solana J, Wolf FA, Ayoub S, Misios A, Glažar P и др. (Май 2018). «Атлас клеточного типа и древо родословной всего сложного животного с помощью одноклеточной транскриптомики» . Наука . 360 (6391): eaaq1723. DOI : 10.1126 / science.aaq1723 . PMID 29674432 .
- ^ Fincher CT, Wurtzel O, de Hoog T, Kravarik KM, Reddien PW (май 2018 г.). "Schmidtea mediterranea" . Наука . 360 (6391): eaaq1736. DOI : 10.1126 / science.aaq1736 . PMC 6563842 . PMID 29674431 .
- ^ Гербер, Тобиас; Муравела, Праяг; Кнапп, Дунья; Масселинк, Воутер; Шуэц, Маритта; Германн, Сара; Gac-Santel, Malgorzata; Новошилов, Сергей; Кагеяма, Хорхе; Хаттак, Шахрияр; Карри, Джошуа Д. (26.10.2018). «Анализ отдельных клеток раскрывает сходимость клеточных идентичностей во время регенерации конечностей аксолотлей» . Наука . 362 (6413): eaaq0681. Bibcode : 2018Sci ... 362..681G . DOI : 10.1126 / science.aaq0681 . ISSN 0036-8075 . PMC 6669047 . PMID 30262634 .
- ^ Ли, Николас Д .; Dunlap, Garrett S .; Джонсон, Кимберли; Мариано, Рашель; Оширо, Рэйчел; Вонг, Алан Й .; Брайант, Дональд М .; Миллер, Бесс М .; Ратнер, Алекс; Чен, Энди; Йе, Уильям У. (2018-12-04). «Транскриптомный ландшафт ниши бластемы в регенерирующих конечностях взрослых аксолотлей при одноклеточном разрешении» . Nature Communications . 9 (1): 5153. Bibcode : 2018NatCo ... 9.5153L . DOI : 10.1038 / s41467-018-07604-0 . ISSN 2041-1723 . PMC 6279788 . PMID 30514844 .
- ^ Wagner DE, Weinreb C, Collins ZM, Briggs JA, Megason SG, Klein AM (июнь 2018 г.). «Одноклеточное картирование ландшафтов экспрессии генов и клонов в эмбрионе рыбок данио» . Наука . 360 (6392): 981–987. Bibcode : 2018Sci ... 360..981W . DOI : 10.1126 / science.aar4362 . PMC 6083445 . PMID 29700229 .
- ^ Фаррелл Дж. А., Ван Й., Ризенфельд С. Дж., Шекхар К., Регев А., Шир А. Ф. (июнь 2018 г.). «Одноклеточная реконструкция траекторий развития во время эмбриогенеза рыбок данио» . Наука . 360 (6392): eaar3131. DOI : 10.1126 / science.aar3131 . PMC 6247916 . PMID 29700225 .
- ^ Зафар Х., Лин С, Бар-Джозеф З. (июнь 2020 г.). «Отслеживание клонов отдельных клеток путем интеграции мутаций CRISPR-Cas9 с транскриптомными данными» . Nature Communications . 3055 (1): 3055. Bibcode : 2020NatCo..11.3055Z . DOI : 10.1038 / s41467-020-16821-5 . PMC 7298005 . PMID 32546686 .
- ^ Бриггс Дж. А., Вайнреб С., Вагнер Д. Е., Мегасон С., Пешкин Л., Киршнер М. В., Кляйн А. М. (июнь 2018 г.). «Динамика экспрессии генов в эмбриогенезе позвоночных при одноклеточном разрешении» . Наука . 360 (6392): eaar5780. DOI : 10.1126 / science.aar5780 . PMC 6038144 . PMID 29700227 .
- ^ Ю Дж. «Научный прорыв 2018 года: отслеживание развития ячейка за ячейкой» . Научный журнал . Американская ассоциация развития науки.
- ^ Куримото К., Ябута Й, Охината Й, Сайто М (2007). «Глобальная одноклеточная амплификация кДНК для обеспечения матрицы для репрезентативного анализа микрочипов олигонуклеотидов высокой плотности». Протоколы природы . 2 (3): 739–52. DOI : 10.1038 / nprot.2007.79 . PMID 17406636 . S2CID 7404545 .
- ^ Ячида С., Джонс С., Бозич И., Антал Т., Лири Р., Фу Б. и др. (Октябрь 2010 г.). «Отдаленные метастазы возникают на поздних стадиях генетической эволюции рака поджелудочной железы» . Природа . 467 (7319): 1114–7. Bibcode : 2010Natur.467.1114Y . DOI : 10,1038 / природа09515 . PMC 3148940 . PMID 20981102 .
- ^ Фрумкин Д., Вассерстрём А., Ицковиц С., Хармелин А., Рехави Г., Шапиро Е. (февраль 2008 г.). «Амплификация нескольких геномных локусов из отдельных клеток, выделенных с помощью лазерного микродиссекции тканей» . BMC Biotechnology . 8 (17): 17. DOI : 10,1186 / 1472-6750-8-17 . PMC 2266725 . PMID 18284708 .
- ^ Далерба П., Калиски Т., Саху Д., Раджендран П.С., Ротенберг М.Э., Лейрат А.А. и др. (Ноябрь 2011 г.). «Одноклеточное рассечение транскрипционной гетерогенности опухолей толстой кишки человека» . Природа Биотехнологии . 29 (12): 1120–7. DOI : 10.1038 / nbt.2038 . PMC 3237928 . PMID 22081019 .
- ^ White AK, VanInsberghe M, Petriv OI, Hamidi M, Sikorski D, Marra MA, et al. (Август 2011 г.). «Высокопроизводительная микрофлюидная одноклеточная RT-qPCR» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 108 (34): 13999–4004. Bibcode : 2011PNAS..10813999W . DOI : 10.1073 / pnas.1019446108 . PMC 3161570 . PMID 21808033 .