Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Примеры пластидов

Транспластомное растение представляет собой генетически модифицированные растения , в которых гены инактивируются, модифицированный или новые чужеродные гены вставляются в ДНК из пластид , как хлоропласт вместо ядерной ДНК.

В настоящее время большинство транспластомных растений являются результатом манипуляций с хлоропластами из-за плохой экспрессии в других пластидах . [1] Однако, этот метод был успешно применен к хромопластам из томатов . [2]

Считается, что хлоропласты в растениях возникли в результате поглощения фотосинтезирующими бактериями ( предками цианобактерий ) эукариотами. [3] Манипуляции с ДНК хлоропластов имеют много преимуществ из-за их бактериального происхождения. Например, возможность вводить несколько генов (оперонов) за один шаг вместо множества шагов и одновременная экспрессия множества генов с его системой экспрессии бактериальных генов. [4] Другие преимущества включают возможность получения органических продуктов, таких как белки, в высокой концентрации, а также тот факт, что на производство этих продуктов не повлияет эпигенетическая регуляция . [5]

Причина синтеза продукта в высоких концентрациях заключается в том, что одна растительная клетка потенциально может нести до 100 хлоропластов. Если все эти пластиды трансформированы, все они могут экспрессировать введенные чужеродные гены. [1] Это может быть выгодно по сравнению с трансформацией ядра, поскольку ядро ​​обычно содержит только одну или две копии гена . [1]

Преимущества, предоставляемые манипуляциями с ДНК хлоропластов, свидетельствуют о растущем интересе к этой области исследований и разработок, особенно в сельскохозяйственных и фармацевтических целях. [5] Однако есть некоторые ограничения в манипуляциях с ДНК хлоропластов, такие как невозможность манипулировать материалом ДНК зерновых культур и плохая экспрессия чужеродной ДНК в незеленых пластидах, как упоминалось ранее. [5] Кроме того, отсутствие возможности посттрансляционной модификации , такой как гликозилирование в пластидах, может затруднить экспрессию некоторых связанных с человеком белков. [6] Тем не менее, в транспластомике растений был достигнут значительный прогресс, например, в производстве съедобных вакцин дляСтолбняк с использованием транспластомного растения табака . [7]

Процедура трансформации и отбора [ править ]

Генная конструкция [ править ]

Схема кассеты растительных генов для транспластомики растений

Первым требованием для создания транспластомных растений является наличие подходящей генной конструкции, которая может быть введена в пластиду, подобную хлоропласту, в форме плазмидного вектора E. coli . [8] Существует несколько ключевых характеристик подходящей кассеты генов, включая, помимо прочего, ( 1 ) селективный маркер ( 2 ) фланкирующие последовательности ( 3 ) представляющий интерес ген ( 4 ) промоторные последовательности ( 5 ) 5 'UTR ( 6 ) 3' UTR ( 7 ) интерцистронные элементы . [9]Селективный маркер обычно является геном устойчивости к антибиотикам, который придает растительной клетке способность выдерживать рост на содержащих антибиотик агаровых чашках. [5] Фланкирующие последовательности имеют решающее значение для введения генной конструкции в точно заданные точки пластидного генома посредством гомологичной рекомбинации . [4] Представленный интересующий ген имеет множество различных применений и может варьироваться от генов устойчивости к вредителям до производства вакцинного антигена. [4] Интерцистронные элементы (ИЭЭ) важны для обеспечения высоких уровней экспрессии генов, если несколько генов вводятся в форме оперона . [4]Наконец, 5 'UTR и 3' UTR усиливают связывание с рибосомами и повышают стабильность транскрипта соответственно. [4]

Преобразование и выделение [ править ]

Наиболее распространенным методом трансформации пластид является биолистика : маленькие частицы золота или вольфрама покрываются плазмидным вектором и вводятся в молодые клетки растений или зародыши растений, проникая в несколько слоев клеток и в пластиду. [8] Затем произойдет событие гомологичной рекомбинации между выстрелом плазмидного вектора и геномом пластиды, что , как мы надеемся, приведет к стабильной вставке генной кассеты в пластиду. [8] Хотя эффективность трансформации ниже, чем у агробактериальныхопосредованная трансформация, которая также обычна в генной инженерии растений, бомбардировка частицами особенно подходит для трансформации хлоропластов. Другие методы трансформации включают использование трансформации, опосредованной полиэтиленгликолем (PEG), которая включает удаление стенки растительной клетки , чтобы подвергнуть «голую» растительную клетку воздействию чужеродного генетического материала для трансформации в присутствии PEG. [8] PEG-опосредованная трансформация, как известно, требует много времени, технических средств и трудозатрат, поскольку требует удаления клеточной стенки, которая является ключевым защитным структурным компонентом растительной клетки. [10]Интересно, что в статье, опубликованной в 2018 году, описана успешная пластидная трансформация хлоропласта из видов микроводорослей N. oceanica и C. reinhardtii посредством электропорации . [10] Несмотря на то, что еще не было предпринято никаких исследований по трансформации пластид высших растений с использованием электропорации, это может быть интересной областью исследований на будущее.

Чтобы существовать и стабильно сохраняться в клетке, молекула плазмидной ДНК должна содержать точку начала репликации , которая позволяет ей реплицироваться в клетке независимо от хромосомы . Когда чужеродная ДНК впервые вводится в ткань растения, не все хлоропласты успешно интегрируют введенный генетический материал. [5] Внутри растительных клеток будет смесь нормального и трансформированного хлоропласта. Эта смесь нормальных и трансформированных хлоропластов определяется как « гетероплазматическая » популяция хлоропластов. [5] Стабильная экспрессия введенного гена требует « гомоплазматического"Население трансформированных хлоропластов в клетках растений, где все хлоропласты в растительной клетке успешно интегрированы в чужеродный генетический материал. [5] Как правило, homoplasmicity могут быть достигнуты и определены с помощью нескольких циклов селекции на антибиотики. [5] Это где трансформированная растительная ткань многократно выращивается на чашках с агаром, которые содержат антибиотики, такие как спектиномицин. [5] Только растительные клетки, которые успешно интегрировали генную кассету, как показано выше, будут способны экспрессировать селектируемый маркер устойчивости к антибиотикам и, следовательно, нормально расти на чашках с агаром. содержащие антибиотики. [5] Растительная тканькоторые не растут нормально, будут иметь обесцвеченный вид, поскольку антибиотик спектиномицин ингибирует рибосомы в пластидах растительной клетки, тем самым предотвращая поддержание хлоропласта [5] Однако, поскольку гетероплазматическая популяция хлоропластов все еще может расти на чашках с агаром по сути, для выращивания гомоплазматической и стабильной ткани растения требуется много раундов отбора антибиотиков и их повторного роста. [5] Создание гомоплазматической растительной ткани считается серьезной трудностью в транспластомике и занимает невероятно много времени. [8]

Пример прививки томата в сельскохозяйственных целях

Прививка [ править ]

Некоторые виды растений, такие как Nicotiana tabacum , более восприимчивы к транспластомике по сравнению с представителями того же рода, такими как Nicotiana glauca и Nicotiana benthamiana . [11] Эксперимент, проведенный в 2012 году, показал возможность облегчения транспластомики сложных видов растений с помощью прививки . Прививка происходит, когда два разных растения соединяются вместе и продолжают расти, этот метод широко используется в сельском хозяйстве и может даже произойти в естественных условиях в дикой природе. [12] Было разработано транспластомное растение N. tabacum , обладающее устойчивостью к спектиномицину и флуоресценцией GFP . [11]В то время как ядерные трансгенные растения N. benthamiana и N. glauca были сконструированы так, чтобы они обладали устойчивостью к антибиотикам канамицина и флуоресценцией YFP . [11] Затем транспластомное растение и ядерные трансгенные растения были привиты друг к другу, а затем трансплантированные ткани были проанализированы. [11] Флуоресцентная микроскопия и отбор антибиотиков на чашках с агаром с канамицином и спектиномицином показали, что транспластомная растительная ткань содержала материал ДНК с транспластомным и ядерным трансгеном. [11] Это было дополнительно подтверждено с помощью ПЦР- анализа. [11]Это исследование показало, что пластиды, такие как хлоропласт, способны проходить между клетками через соединения трансплантата и приводить к переносу генетического материала между двумя разными линиями растительных клеток. [11] Это открытие важно, поскольку оно обеспечивает альтернативный путь для создания транспластомных растений для видов, которые не так легко трансформируются с использованием нашей текущей экспериментальной методологии, как показано выше. [11]

Оптимизация экспрессии трансгена [ править ]

Индуцируемые системы экспрессии , такие как теоретические переключатели и белки с пентатрикопептидными повторами , широко изучались в попытке контролировать и модулировать экспрессию продуктов трансгена в транспластомных растениях. [13] Одним из больших преимуществ использования индуцибельных систем экспрессии является оптимизация концентрации продукции трансгенного белка. [13] Например, молодые растения должны тратить энергию и ресурсы на рост и развитие, чтобы стать зрелыми. [13] Конститутивная экспрессия трансгена, таким образом, будет вредна для роста и развития растений, поскольку вместо этого отнимает ценную энергию и ресурсы для экспрессии чужеродной генной конструкции.[13] В результате получится плохо развитое транспластомное растение с низким выходом продукта. [13] Индуцируемая экспрессия трансгена могла бы преодолеть это ограничение и позволить растению полностью созреть, как нормальноерастение дикого типа, прежде чем оно будет химически индуцировано для начала продуцирования трансгена, который затем может быть собран. [13]

Биологическое сдерживание и сельскохозяйственное сосуществование [ править ]

Табак Nicotiana

Генетически модифицированные растения должны быть безопасными для окружающей среды и подходить для сосуществования с обычными и органическими культурами . Главное препятствие для традиционных ядерных генетически модифицированных культур ставятся потенциальным ауткроссингом в трансгене через движение пыльцы. Первоначально считалось, что пластидная трансформация, которая дает транспластомные растения, пыльца которых не содержит трансген, не только повышает биобезопасность, но также способствует сосуществованию генетически модифицированного, традиционного и органического сельского хозяйства. Поэтому выращивание таких культур было основной целью таких исследовательских проектов, как Co-Extra и Transcontainer.

Однако исследование табака, проведенное в 2007 году, опровергло эту теорию. Под руководством Ральфа Бока из Института молекулярной физиологии растений им. Макса Планка в Германии исследователи изучали генетически модифицированный табак, в котором трансген интегрирован в хлоропласты. [14] Транспластомное растение табака, полученное посредством трансформации, опосредованной хлоропластом, скрещивали с растениями, которые были стерильными по мужской линии с нетронутым хлоропластом. [14] Транспластомные растения были сконструированы так, чтобы иметь устойчивость к антибиотику спектиномицину, и были сконструированы для производства зеленой флуоресцентной белковой молекулы (GFP). [14]Поэтому была выдвинута гипотеза, что любое потомство, полученное от этих двух линий табака, не должно быть способно расти на спектиномицине или быть флуоресцентным, поскольку генетический материал в хлоропласте не должен передаваться через пыльцу. [14] Однако было обнаружено, что некоторые семена были устойчивы к антибиотику и могли прорастать на чашках с агаром со спектиномицином. [14] Расчеты показали, что 1 из каждого миллиона пыльцевых зерен содержит генетический материал пластид, что может иметь большое значение в условиях сельскохозяйственной фермы. [14]Поскольку табак имеет сильную тенденцию к самооплодотворению, предполагается, что надежность транспластомных растений еще выше в полевых условиях. Таким образом, исследователи считают, что только одно из 100000000 ГМ-растений табака действительно может передавать трансген через пыльцу. Такие ценности более чем достаточны для обеспечения сосуществования. Тем не менее, для ГМ-культур, используемых в производстве фармацевтических препаратов, или в других случаях, когда недопустимо полное скрещивание, исследователи рекомендуют сочетание трансформации хлоропластов с другими биологическими методами сдерживания , такими как цитоплазматическая мужская стерильностьили стратегии смягчения последствий трансгенов. Это исследование показало, что хотя транспластомные растения не обладают абсолютной защитой генов, уровень сдерживания чрезвычайно высок и позволяет сосуществовать как обычным, так и генетически модифицированным сельскохозяйственным культурам. [14]

Общественность обеспокоена возможной передачей генов устойчивости к антибиотикам нежелательным мишеням, включая бактерии и сорняки. [15] В результате были разработаны технологии удаления селектируемого маркера гена устойчивости к антибиотикам. Одной из таких технологий, которая была реализована, является система Cre / lox , в которой кодируемая ядром рекомбиназа Cre может быть помещена под контроль индуцибельного промотора для удаления гена устойчивости к антибиотикам после достижения гомоплазмичности в процессе трансформации. [16]

Личинки картофельного жука

Примеры и будущее [ править ]

Недавний пример транспластомики в сельском хозяйстве - защита растений картофеля от колорадского жука . [17] Этого жука на международном уровне называют «супер-вредителем», потому что он приобрел устойчивость ко многим инсектицидам и является чрезвычайно прожорливым питателем. [17] Только в Мичигане ежегодно жук причиняет ущерб урожаю на сумму до 1,4 миллиона долларов США. [18] В исследовании, проведенном в 2015 году Чжаном, использовалась транспластомика для введения трансгенов, продуцирующих двухцепочечную РНК, в пластидный геном. [17] Двухцепочечная РНК обеспечивает защиту трансгенного растения картофеля черезМетодология РНК-интерференции , при которой потребление растительной ткани картофельным жуком привело бы к подавлению ключевых генов, необходимых жуку для выживания. [17] Обеспечивается высокий уровень защиты, листья транспластомного растения картофеля в основном не расходуются при контакте со взрослыми жуками и личинками. [17] Исследование также выявило 83% -ную эффективность уничтожения личинок, которые съели листья транспластомного растения. [17] Это исследование подчеркивает, что по мере того, как вредители приобретают устойчивость к традиционным химическим инсектицидам, использование транспластомики для реализации стратегий защиты растений, опосредованных RNAI, может стать все более жизнеспособным в будущем. [17]

Другой известный подход, основанный на транспластомике, - это производство артемизиновой кислоты через транспластомные растения табака, который является молекулой-предшественником, которую можно использовать для производства артемизинина . [19] Комбинированная терапия на основе артемизинина является предпочтительным и рекомендованным лечением выбора ВОЗ (Всемирной организацией здравоохранения) против малярии . [19] Артемизинин естественным образом получают из растения Artemisia annua , однако, только низкие концентрации артемизинина в растении могут быть получены естественным путем, и в настоящее время его недостаточно для удовлетворения мирового спроса. [19]Исследование , проведенное в 2016 году под руководством Fuentes, удалось ввести artemisininic кислоты производственный путь в хлоропласте Н. аЬасит через биолистики подойти перед использованием их новой синтетической биологии инструмент фляжка с ушками для подвешивания ( совместное mbinatorial с upertransformation из т ransplastomic г ecipient л INES) к создать транспластомное растение N. tabacum, которое имело очень высокий выход кислоты артеминизина. [20] Это исследование иллюстрирует потенциальные преимущества транспластомики для био-фармацевтических применений в будущем.

Несмотря на то, что транспластомика в настоящее время нежизнеспособна для незеленых пластид, работа по транспластомике растений, проведенная над геномом хлоропласта, оказалась чрезвычайно полезной. [4] Применение трансформации хлоропластов включает в себя, помимо прочего, сельское хозяйство, биотопливо и биофармацевтику. [4] Это происходит из-за нескольких факторов, в том числе легкости экспрессии множественных трансгенов в форме оперонов и экспрессии большого числа копий. [4] Изучение транспластомики все еще продолжается. По-прежнему требуются дополнительные исследования и разработки для улучшения других областей, таких как транспластомика незеленых пластид, невозможность трансформации зерновых культур с помощью транспластомики и способ обойти недостатокспособность к гликозилированию в хлоропласте. [4] Дальнейшие улучшения в этой области исследований дадут нам только потенциальный надежный биотехнологический путь для многих приложений, важных в нашей повседневной жизни.

Ссылки [ править ]

  1. ^ a b c Ригано М.М., Скотти Н., Карди Т. (2012-11-24). «Нерешенные проблемы трансформации пластид» . Биоинженерия . 3 (6): 329–33. DOI : 10.4161 / bioe.21452 . PMC  3489708 . PMID  22892591 .
  2. ^ Ruf, S .; Hermann, M .; Berger, I .; Carrer, H .; Бок, Р. (2001). «Стабильная генетическая трансформация пластид томата и экспрессия чужеродного белка в плодах». Природа Биотехнологии . 19 (9): 870–875. DOI : 10.1038 / nbt0901-870 . PMID 11533648 . S2CID 39724384 .  
  3. ^ Raven JA, Allen JF (2003). «Геномика и эволюция хлоропластов: что цианобактерии сделали для растений?» . Геномная биология . 4 (3): 209. DOI : 10,1186 / GB-2003-4-3-209 . PMC 153454 . PMID 12620099 .  
  4. ^ Б с д е е г ч я Адем M, D, Beyene Feyissa T (2017-04-01). «Последние достижения, полученные при трансформации хлоропластов» . Растительные методы . 13 (1): 30. DOI : 10,1186 / s13007-017-0179-1 . PMC 5395794 . PMID 28428810 .  
  5. ^ a b c d e f g h i j k l Ахмад Н., Мишу Ф., Lössl AG, Nixon PJ (ноябрь 2016 г.). «Проблемы и перспективы коммерциализации технологии трансформации пластид» . Журнал экспериментальной ботаники . 67 (21): 5945–5960. DOI : 10.1093 / JXB / erw360 . PMID 27697788 . 
  6. ^ Faye, L .; Даниэлл, Х. (19 января 2006 г.). «Новые пути импорта гликопротеина в хлоропласты» . Журнал биотехнологии растений . 4 (3): 275–279. DOI : 10.1111 / j.1467-7652.2006.00188.x . ISSN 1467-7644 . PMID 17147633 .  
  7. ^ Tregoning J, Maliga P, G Довгань, Никсон PJ (апрель 2004). «Новые достижения в производстве вакцин для съедобных растений: хлоропластная экспрессия антигена противостолбнячной вакцины, TetC». Фитохимия . 65 (8): 989–94. DOI : 10.1016 / j.phytochem.2004.03.004 . PMID 15110679 . 
  8. ^ a b c d e Wani, Shabir H .; Хайдер, Надя; Сингх, Хитеш Кумар и Н.Б. (2010-10-31). "Завод Пластид Инжиниринг" . Текущая геномика . 11 (7): 500–512. DOI : 10.2174 / 138920210793175912 . PMC 3048312 . PMID 21532834 .  
  9. Перейти ↑ Verma D, Daniell H (декабрь 2007 г.). «Векторные системы хлоропластов для биотехнологических приложений» . Физиология растений . 145 (4): 1129–43. DOI : 10.1104 / pp.107.106690 . PMC 2151729 . PMID 18056863 .  
  10. ^ а б Гань, Циньхуа; Цзян, Цзяоюнь; Хан, Сяо; Ван, Шифань; Лу, Янду (2018). "Разработка хлоропластного генома маслянистой морской микроводоросли Nannochloropsis oceanica" . Границы растениеводства . 9 : 439. DOI : 10.3389 / fpls.2018.00439 . ISSN 1664-462X . PMC 5904192 . PMID 29696028 .   
  11. ^ a b c d e f g h Стегеманн, Сандра; Кеут, Мэнди; Грейнер, Стефан; Бок, Ральф (14 февраля 2012 г.). «Горизонтальный перенос геномов хлоропластов между видами растений» . Труды Национальной академии наук . 109 (7): 2434–2438. Bibcode : 2012PNAS..109.2434S . DOI : 10.1073 / pnas.1114076109 . ISSN 0027-8424 . PMC 3289295 . PMID 22308367 .   
  12. Перейти ↑ Goldschmidt, Eliezer E. (2014-12-17). «Прививка растений: новые механизмы, эволюционные последствия» . Границы растениеводства . 5 : 727. DOI : 10.3389 / fpls.2014.00727 . ISSN 1664-462X . PMC 4269114 . PMID 25566298 .   
  13. ^ a b c d e f Рохас, Маргарита; Юй Циго; Уильямс-Кэрриер, Розалинда; Малига, Пал; Баркан, Алиса (2019-04-29). «Сконструированные белки PPR как индуцибельные переключатели для активации экспрессии трансгенов хлоропластов» . Природа Растения . 5 (5): 505–511. DOI : 10.1038 / s41477-019-0412-1 . ISSN 2055-0278 . PMID 31036912 . S2CID 139103684 .   
  14. ^ Б с д е е г Руф S, D Karcher, Bock R (апрель 2007 г.). «Определение уровня содержания трансгена, обеспечиваемого трансформацией хлоропластов» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 104 (17): 6998–7002. DOI : 10.1073 / pnas.0700008104 . PMC 1849964 . PMID 17420459 .  
  15. ^ Пухта H (2003-08-01). «Безмаркерные трансгенные растения». Культура растительных клеток, тканей и органов . 74 (2): 123–134. DOI : 10,1023 / A: 1023934807184 . S2CID 5585801 . 
  16. Перейти ↑ Bala A, Roy A, Das A, Chakraborti D, Das S (октябрь 2013 г.). «Разработка не содержащих селектируемых маркеров, устойчивых к насекомым, трансгенных растений горчицы (Brassica juncea) с использованием Cre / lox-опосредованной рекомбинации» . BMC Biotechnology . 13 (1): 88. DOI : 10,1186 / 1472-6750-13-88 . PMC 3819271 . PMID 24144281 .  
  17. ^ Б с д е е г Zhang, Jiang; Хан, Шер Афзал; Хассе, Клаудиа; Руф, Стефани; Хекель, Дэвид Дж .; Бок, Ральф (27 февраля 2015 г.). «Полная защита растений от насекомых-вредителей путем экспрессии длинных двухцепочечных РНК в пластидах». Наука . 347 (6225): 991–994. Bibcode : 2015Sci ... 347..991Z . DOI : 10.1126 / science.1261680 . ISSN 0036-8075 . PMID 25722411 . S2CID 206563127 .   
  18. ^ Графиус, Э. (1997-10-01). «Экономическое влияние устойчивости колорадского жука к инсектицидам (Coleoptera: Chrysomelidae) на картофельную промышленность штата Мичиган» . Журнал экономической энтомологии . 90 (5): 1144–1151. DOI : 10.1093 / JEE / 90.5.1144 . ISSN 0022-0493 . 
  19. ^ а б в Икрам, Нур КБК; Симонсен, Хенрик Т. (15.11.2017). «Обзор биотехнологического производства артемизинина в растениях» . Границы растениеводства . 8 : 1966. DOI : 10.3389 / fpls.2017.01966 . ISSN 1664-462X . PMC 5694819 . PMID 29187859 .   
  20. ^ Фуэнтес, Паулина; Чжоу, Фэй; Эрбан, Александр; Керхер, Дэниел; Копка, Иоахим; Бок, Ральф (2016-06-14). «Новый подход синтетической биологии позволяет перенести весь метаболический путь от лекарственного растения к урожаю биомассы» . eLife . 5 : e13664. DOI : 10.7554 / eLife.13664 . ISSN 2050-084X . PMC 4907697 . PMID 27296645 .   

Внешние ссылки [ править ]

  • Дополнительные исследования сосуществования и отслеживаемости генетически модифицированных растений
  • Трансконтейнер Разработка систем биологической защиты для генетически модифицированных растений