Из Википедии, бесплатной энциклопедии
Перейти к навигации Перейти к поиску
Agroinfiltration.jpg

Агроинфильтрации является метод , используемый в биологии растений и , особенно , в последнее время в биотехнологии растений , чтобы вызвать временную экспрессию из генов в растения , или изолированных листьев из растения, или даже в культурах клеток растений, с целью получения желаемого белка . В способе суспензии из Agrobacterium tumefaciens , вводят в лист растений путем прямой инъекцией или путем вакуумной инфильтрации или введена в ассоциацию с клетками растений , иммобилизованных на пористом носителе (растительные клетки упаковки), [1] после чего передать бактерии желаемых ген в клетки растенийчерез перенос Т-ДНК . Основным преимуществом агроинфильтрации по сравнению с более традиционной трансформацией растений является скорость и удобство, хотя выходы рекомбинантного белка, как правило, также выше и стабильнее.

Первым шагом является введение интересующего гена в штамм из Agrobacterium tumefaciens . Затем штамм выращивают в жидкой культуре, а полученные бактерии промывают и суспендируют в подходящем буферном растворе . Для инъекции этот раствор затем помещается в шприц (без иглы). Кончик шприца прижимается к нижней стороне листа , одновременно прикладывая легкое противодавление к другой стороне листа. Затем суспензия Agrobacterium вводится в воздушное пространство внутри листа через устьица или иногда через крошечный разрез на нижней стороне листа.

Вакуумная инфильтрация - еще один способ проникновения Agrobacterium глубоко в ткань растения. В этой процедуре листовые диски, листья или целые растения погружаются в стакан, содержащий раствор, и стакан помещается в вакуумную камеру. Затем применяется вакуум, вытесняя воздух из межклеточных пространств в листьях через устьица. Когда вакуум сбрасывается, разность давлений выталкивает суспензию «Agrobacterium» в листья через устьица в ткань мезофилла . Это может привести к тому, что почти все клетки любого листа будут контактировать с бактериями.

Попав внутрь листа, Agrobacterium остается в межклеточном пространстве и переносит интересующий ген как часть T-ДНК, полученной из плазмиды Ti, в больших количествах копий в клетки растений. Передача гена происходит, когда индуцируются растительные сигналы и устанавливается физический контакт между растительными клетками и бактериями. Бактерии создают механизм, который прокладывает дыру и переносит новую цепь Т-ДНК в клетку растения. Т-ДНК перемещается в ядро ​​растения и начинает интегрироваться в хромосому растения. Затем ген временно экспрессируется посредством синтеза РНК из соответствующих промоторных последовательностей во всех трансфицированных клетках (отбор на стабильную интеграцию не производится). За растением можно следить на предмет возможного влияния на фенотип., подвергают экспериментальным условиям или собирают и используют для очистки представляющего интерес белка . С помощью этого метода можно обрабатывать многие виды растений, но наиболее распространенными являются Nicotiana benthamiana и, реже, Nicotiana tabacum .

Временная экспрессия в пакетах культивируемых растительных клеток - это новая процедура, недавно запатентованная Институтом Фраунгофера IVV, Германия. [2] Для этого метода культивируемые в суспензии клетки табака (например: линии клеток NT1 или BY2 Nicotiana tabacum ) иммобилизуют путем фильтрации на пористой подложке с образованием хорошо аэрированной клеточной упаковки, затем инкубируют с рекомбинантными Agrobacterium в течение некоторого времени до разрешить перенос Т-ДНК перед повторной фильтрацией для удаления излишков бактерий и жидкости. Инкубация клеточного пакета во влажной среде в течение периодов времени до нескольких дней обеспечивает временную экспрессию белка. Секретированные белки можно вымыть из упаковки клеток путем применения буфера и дальнейшей фильтрации.

Глушители подавления при агроинфильтрации [ править ]

Агроинфильтрация с использованием конструкции промотор :: GUS в Nicotiana benthamiana "с TBSV p19 (правый листовой диск) и без TBSV p19 (левый листовой диск).

Довольно часто Agrobacterium, несущая интересующую конструкцию, совместно с другой Agrobacterium, несущей ген белка-супрессора сайленсинга, например, кодирующий белок p19 из патогенного вируса кустистости томатов (TBSV), или белок NSs [3] из вирус пятнистого увядания томатов (TSWV). TBSV был впервые обнаружен в 1935 году у томатов, и в результате были получены растения с задержкой роста и деформированными плодами. TSWV был обнаружен в помидорах в Австралии в 1915 году и в течение многих лет был единственным представителем того, что сейчас известно как род Tospovirus , семейство Bunyaviridae .

Чтобы защитить себя от вирусов и других патогенов, которые вводят чужеродные нуклеиновые кислоты в свои клетки, растения разработали систему посттранскрипционного сайленсинга генов (PTGS), при которой небольшие интерферирующие РНК продуцируются из двухцепочечной РНК для создания последовательности специфический путь деградации, который эффективно заглушает неродные гены. [4] [5] Многие вирусы растений разработали механизмы, которые противодействуют системам PTGS растений с помощью эволюционирующих белков, таких как p19 и NS, которые мешают пути PTGS на разных уровнях. [6] [7] [8]

Хотя неясно, как именно p19 подавляет молчание РНК, исследования показали, что временно экспрессируемые белки в листьях Nicotiana benthamiana имеют до 50 раз более высокий выход при совместной фильтрации с TBSV p19. [9] [10]

TSWV и другие белки NS тосповируса, как было показано, эффективны в качестве супрессоров как местного, так и системного сайленсинга [11], и могут быть полезной альтернативой p19, где было показано, что последний не эффективен. В других исследованиях было показано , что p19 из вируса крапчатой ​​морщинистости артишока имеет сходный, хотя и более слабый, эффект с TBSV p19. [12]

См. Также [ править ]

  • Агробактерии
  • Переходное выражение

Ссылки [ править ]

  1. ^ | url = https://www.researchgate.net/project/Plant-cell-pack-aka-cookie-technology
  2. ^ «Метод создания и выращивания пакета растительных клеток» .
  3. ^ Такеда, А; Сугияма, К. Нагано, Н; Мори, М; Кайдо, М; Mise, K; Цуда, S; Окуно, Т. (2002). «Идентификация нового супрессора подавления РНК, белка NSs вируса пятнистого увядания томатов» . FEBS Lett . 532 (1–2): 75–9. DOI : 10.1016 / s0014-5793 (02) 03632-3 . PMID 12459466 . 
  4. ^ Хаммонд, Скотт М .; Caudy, Эми A .; Хэннон, Грегори Дж. (Февраль 2001 г.). «Посттранскрипционное молчание гена с помощью двухцепочечной РНК». Природа Обзоры Генетики . 2 (2): 110–119. DOI : 10.1038 / 35052556 . PMID 11253050 . 
  5. ^ Йохансен, Лиза К .; Кэррингтон, Джеймс К. (2001-07-01). «Молчание на месте. Индукция и подавление молчания РНК в системе временной экспрессии, опосредованной Agrobacterium» . Физиология растений . 126 (3): 930–938. DOI : 10.1104 / pp.126.3.930 . ISSN 1532-2548 . PMC 1540124 . PMID 11457942 .   
  6. ^ Anandalakshmi, Radhamani; Прусс, Гейл Дж .; Ге, Синь; Марат, Раджендра; Мэллори, Эллисон С .; Смит, Трентон Х .; Вэнс, Вики Б. (1998-10-27). «Вирусный супрессор сайленсинга генов у растений» . Труды Национальной академии наук . 95 (22): 13079–13084. DOI : 10.1073 / pnas.95.22.13079 . ISSN 0027-8424 . PMC 23715 . PMID 9789044 .   
  7. ^ Kasschau, Кристин Д .; Кэррингтон, Джеймс К. (1998-11-13). «Стратегия защиты от вирусов растений». Cell . 95 (4): 461–470. DOI : 10.1016 / S0092-8674 (00) 81614-1 . ISSN 0092-8674 . PMID 9827799 .  
  8. ^ Voinnet, Оливье (2001-08-01). «РНК сайленсинг как иммунная система растений против вирусов». Тенденции в генетике . 17 (8): 449–459. DOI : 10.1016 / S0168-9525 (01) 02367-8 . ISSN 0168-9525 . PMID 11485817 .  
  9. ^ Воиннет, Оливье; Ривас, Сусана; Местре, Пере; Баулкомб, Дэвид (2003-03-01). «Retracted: усиленная система временной экспрессии в растениях, основанная на подавлении сайленсинга гена белком p19 вируса кустарникового роста томатов» . Заводской журнал . 33 (5): 949–956. DOI : 10.1046 / j.1365-313X.2003.01676.x . ISSN 1365-313X . PMID 12609035 . S2CID 2412771 .   
  10. ^ "Retraction: 'Улучшенная временная система экспрессии в растениях, основанная на подавлении сайленсинга генов белком p19 вируса кустарникового роста томатов ' " . Заводской журнал . 84 (4): 846. 01.11.2015. DOI : 10.1111 / tpj.13066 . ISSN 1365-313X . PMID 27170951 .  
  11. ^ Hedil, M; Стеркен, MG; де Ронд, Д; Lohuis, D; Кормелинк, Р (2015). «Анализ белков NS тосповируса в подавлении системного молчания» . PLOS ONE . 10 (8): e0134517. DOI : 10.1371 / journal.pone.0134517 . PMC 4537313 . PMID 26275304 .  
  12. ^ Ломбарди, Раффаэле; Чирчелли, Патриция; Виллани, Мария; Буриани, Джампаоло; Нарди, Лука; Коппола, Валентина; Бьянко, Линда; Бенвенуто, Эухенио; Донини, Марчелло (20 ноября 2009 г.). «Высокий уровень временной экспрессии Nef ВИЧ-1 в Nicotiana benthamiana с использованием белка-супрессора, подавляющего подавление гена P19, орфографической ошибки с крапчатой ​​морщиной артишока в названии вируса» . BMC Biotechnology . 9 (1): 96. DOI : 10,1186 / 1472-6750-9-96 . PMC 2785776 . PMID 19930574 .